Este protocolo permite o isolamento perfeito, a culminação e o interrogatório de respostas transcricionais em uma linhagem celular específica de C.elegans. A principal vantagem deste protocolo é o alto nível de adaptabilidade a diferentes estágios de vida de vermes ou tipos de células específicas a serem isolados. Demonstrando o procedimento seremos eu e Nataliya Zahayko, uma técnica do nosso laboratório.
Depois de coletar os animais, centrifuá-los a 1600 vezes g por cinco minutos. Remova todos os supernascentes e resuspense os vermes em um mililitro da mídia M9. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a 1600 vezes g por cinco minutos para pelotar os vermes. Em seguida, adicione 200 microliters de tampão SDS-DTT e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Os vermes agora parecem estar enrugados ao longo do corpo se vistos sob um microscópio leve.
Em seguida, adicione 800 microliters de tampão de isolamento gelado e misture movendo suavemente o tubo. Centrifugar a 13.000 vezes g e a quatro graus Celsius por um minuto para pelotar os vermes. Remova o supernatante e lave com um mililitro de tampão de isolamento.
Repita o processo de centrifugação e lavagem um total de cinco vezes, certificando-se de remover cuidadosamente o tampão de isolamento cada vez. Depois disso, adicione 100 microliters de mistura de protease de Streptomyces griseus, dissolvido em tampão de isolamento, à pelota. Incubar em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, certificando-se de aplicar interrupção mecânica ao subir e descer 60 a 70 vezes com uma ponta de micropipette de 200 microliter contra a parte inferior do tubo.
Para determinar o estágio da digestão, remova de um a cinco microlitros da mistura de digestão, solte-a em um slide de vidro e inspecione-a usando um microscópio de cultura tecidual. Após cinco a sete minutos, fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e um chorume de células será facilmente visível. Pare a reação adicionando 900 microliters do meio L-15 de Leibovitz comercialmente disponível, complementado com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina.
Centrífuga a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos para pelotas fragmentos isolados e células. Lave as células pelotas mais duas vezes com mídia l-15 resfriada usando um mililitro de mídia por lavagem. Resuspenda as células pelotas em um mililitro de L-15 de mídia suplementada, e deixe no gelo por 30 minutos.
Em seguida, pegue a camada superior, que é aproximadamente 700 a 800 microliters, e transfira-a para um tubo de microcentrifuge. Use um contador celular automatizado ou hemacytómetro para medir a densidade celular de 10 a 25 microliters de células isoladas. Células centrífugas da suspensão celular isolada a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Descarte o supernasal e resuspenque as células pelleted em L-15 complementado médio a uma densidade celular de não mais de seis milhões de células por mililitro para evitar sobrecarregar o citómetro de fluxo. Em seguida, classifique células por expressão GFP-positive usando um citômetro de fluxo capaz de classificar amostras. As células GFP-negativas podem ser usadas como um controle para análises não específicas do tipo celular.
Depois disso, coloque as células isoladas nos poços de uma placa estéril de seis poços, coloque a placa em um recipiente plástico, adicione um lenço úmido ou papel de tecido mole para adicionar umidade às células e incubar a 20 graus Celsius. Células centrífugas da suspensão celular isolada em um tubo de microcentrifusagem sem RNase de 1,5 mililitro a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos. Usando uma micropipette, remova o supernascer e adicione 100 microliters de m9 médio para lavar o meio L-15.
Em seguida, centrifugar as células a 10.000 vezes g e a quatro graus Celsius por cinco minutos e remover o supernasce. Repita este processo de lavagem e centrifugação três vezes maior para garantir que toda a mídia seja removida, certificando-se de remover cuidadosamente o supernatante cada vez. Em seguida, adicione um mililitro de solução de isothiocianato de fenol e guanidina às células e pipeta a suspensão para cima e para baixo cuidadosamente.
Incubar a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois disso, adicione 250 microliters de clorofórmio e inverta suavemente o tubo 15 a 20 vezes. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Centrifugar a 10.000 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos. Use uma micropipette para remover cuidadosamente o máximo possível da camada aquosa superior, certificando-se de não perturbar as camadas orgânicas inferiores. Transfira a camada inferior para um novo tubo de microcentrifuge sem 1,5 mililitros RNase.
Ao novo tubo, adicione 500 microliters de isopropanol e misture invertendo o tubo. Incubar esta solução em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifugar o tubo a 14.000 vezes g e a 25 graus Celsius por 20 minutos.
Coloque as amostras no gelo e use uma micropipette para remover o máximo de isopropanol possível. Adicione suavemente um mililitro de 70% de etanol na água dupla-destilada sem RNase ao tubo, aplicando-o ao lado do tubo. Centrifugar a 10.000 vezes g e a 25 graus Celsius por cinco minutos.
Retire a maior parte do etanol e deixe o tubo secar no gelo por três a cinco minutos. Depois disso, adicione 15 a 20 microliters de água dupla-destilada sem RNase. Use um espectótmetro a 260 nanômetros para medir a concentração e pureza do RNA.
Neste estudo, os neurônios colinérgicos unc-17:GFP positivo são extraídos e isolados da lombriga C.elegans para estudos ex vivo subsequentes. O gene unc-17 é expresso em todo o corpo C.elegans, e códigos para um transporte transmembrano de acetilcolina vesicular. A expressão deste gene pode ser observada em neurônios de cabeça, corpo médio e cauda, e projeções de neurônios.
Micrografos representativos de fluorescência de neurônios unc-17:GFP positivo após o isolamento, bem como um respectivo controle negativo de animais selvagens N2 não modificados, são mostrados aqui. As células isoladas podem permanecer vivas até três dias quando suplementadas com o meio L-15 de Leibovitz e 10% FBS. Dados representativos de qPCR de neurônios colinérgicos que expressam GFP, bem como células musculares que expressam GFP, são mostrados aqui.
Após a triagem com sucesso das células, o RNA é isolado através de um método de isothiocnato de fenol e guanidina, após o qual o CDNA foi produzido usando um kit de síntese. A expressão de genes específicos de neurônios colinérgicos, tph-1, um hidroxilase triptofano, e snb-1, um transportador de vesícula sináptica, é elevada em células isoladas unc-17:GFP. No entanto, essa expressão não está presente em células isoladas myo-3:GFP.
O inverso é verdadeiro com a expressão da transcrição da cadeia de mio-2 específica da minodeira, já que a expressão deste gene é limitada a células musculares isoladas, mas não às células colinérgicas isoladas. É importante incubar os vermes completamente. No entanto, a incubação prolongada da cutícula do verme pode resultar em morte de vermes ou estresse adicional ao animal.
Após o isolamento, as células podem ser cultivadas por um período de tempo, ou usadas para isolamento de RNA e análise de qRT-PCR. Neurônios cultivados podem ser analisados por medidas de eletroforese de grampo de remendo. Essa técnica pode facilitar a análise ex vivo de grupos específicos de células, ajudando assim a melhorar nossa compreensão das respostas específicas das células no contexto de organismos multicelulares em vários estágios de seu ciclo de vida.
Como produtos químicos como SDS e DTT são usados durante este experimento, os procedimentos gerais de segurança do laboratório devem ser seguidos durante a fabricação e o uso de buffers.
