Este protocolo permite el aislamiento, el cultivo y el interrogatorio sin fisuras de las respuestas transcripcionales en un linaje celular específico de C.elegans. La principal ventaja de este protocolo es el alto nivel de adaptabilidad a diferentes etapas de vida de gusanos o tipos de células específicos que se van a aislar. Demostrando el procedimiento seremos Nataliya Zahayko y yo, una técnico de nuestro laboratorio.
Después de recoger los animales, centrifugarlos a 1600 veces g durante cinco minutos. Retire todo el sobrenadante y resusppend los gusanos en un mililitro de medios M9. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar a 1600 veces g durante cinco minutos para peletizar los gusanos. A continuación, agregue 200 microlitros de tampón SDS-TDT e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Los gusanos ahora deben parecer arrugados a lo largo del cuerpo si se ven bajo un microscopio de luz.
A continuación, agregue 800 microlitros de tampón de aislamiento frío y mezcle moviendo suavemente el tubo. Centrifugar a 13.000 g y a cuatro grados celsius durante un minuto para hacer pellets de los gusanos. Retire el sobrenadante y lávelo con un mililitro de tampón de aislamiento.
Repita la centrifugación y el proceso de lavado un total de cinco veces, asegurándose de retirar cuidadosamente el búfer de aislamiento cada vez. Después de esto, añadir 100 microlitros de la mezcla de proteasa de Streptomyces griseus, disuelto en tampón de aislamiento, al pellet. Incubar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, asegurándose de aplicar la interrupción mecánica pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 60 a 70 veces con una punta de micropipeta de 200 microlitrólitros contra la parte inferior del tubo.
Para determinar la etapa de digestión, retire de uno a cinco microlitros de la mezcla de digestión, suéltelo en un portaobjetos de vidrio e inspeccione con un microscopio de cultivo de tejido. Después de cinco a siete minutos, los fragmentos de gusano deben tener una cutícula visiblemente reducida y una suspensión de las células será fácilmente visible. Detenga la reacción añadiendo 900 microlitros del medio L-15 de Leibovitz disponible comercialmente, complementado con 10%FBS y penicilina-estreptomicina.
Centrifugar a 10.000 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para peletizar fragmentos aislados y células. Lavar las células peletadas dos veces más con medios fríos L-15 suplementados usando un mililitro de medios por lavado. Resuspender las células peletadas en un mililitro de L-15 medios suplementados, y dejar en hielo durante 30 minutos.
A continuación, tome la capa superior, que es aproximadamente 700 a 800 microlitros, y transfiérala a un tubo de microcentrífuga. Utilice un contador de células automatizado o hemacytómetro para medir la densidad celular de 10 a 25 microlitros de células aisladas. Células centrífugas de la suspensión celular aislada a 10.000 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y resusppend las células peletadas en L-15 suplementada media a una densidad celular de no más de seis millones de células por mililitro para evitar sobrecargar el citómetro de flujo. A continuación, ordene las células por expresión GFP positiva utilizando un citómetro de flujo capaz de ordenar muestras. Las celdas negativas GFP se pueden utilizar como control para el análisis no específico del tipo de celda.
Después de esto, plato las células aisladas en los pozos de una placa estéril de seis pozos, colocar la placa en un recipiente de plástico, añadir una toallita húmeda o papel de tejido suave para agregar humedad a las células, e incubar a 20 grados Celsius. Células centrífugas de la suspensión celular aislada en un tubo de microcentrífuga sin RNase de 1,5 mililitros a 10.000 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Con una micropipeta, retire el sobrenadante y añada 100 microlitros de M9 medium para lavar el medio suplementado L-15.
A continuación, centrifugar las células a 10.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y retire el sobrenadante. Repita este proceso de lavado y centrifugación tres veces en total para asegurarse de que se retiran todos los medios, asegurándose de retirar cuidadosamente el sobrenadante cada vez. Luego, agregue un mililitro de solución de isotiocianato de fenol y guanidina a las células y pipetee la suspensión hacia arriba y hacia abajo con cuidado.
Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de esto, agregue 250 microlitros de cloroformo e invierta suavemente el tubo de 15 a 20 veces. Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Centrifugar a 10.000 g y a 25 grados centígrados durante cinco minutos. Utilice una micropipeta para eliminar cuidadosamente la mayor parte de la capa acuosa superior como sea posible, asegurándose de no perturbar las capas orgánicas inferiores. Transfiera la capa inferior a un nuevo tubo de microcentrífuga sin RNase de 1,5 mililitros.
Al nuevo tubo, añadir 500 microlitros de isopropanol y mezclar invirtiendo el tubo. Incubar esta solución a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego centrifuga el tubo a 14.000 veces g y a 25 grados centígrados durante 20 minutos.
Coloque las muestras sobre hielo y utilice una micropipeta para eliminar la mayor cantidad posible de isopropanol. Agregue suavemente un mililitro de 70% de etanol en agua doble destilada sin RNase al tubo aplicándolo en el lado del tubo. Centrifugar a 10.000 g y a 25 grados centígrados durante cinco minutos.
Retire la mayor parte del etanol y deje que el tubo se seque al aire sobre hielo durante tres a cinco minutos. Después de esto, agregue de 15 a 20 microlitros de agua doble destilada sin RNase. Utilice un espectrofotómetro a 260 nanómetros para medir la concentración y pureza del ARN.
En este estudio, unc-17:GFP-positiva neuronas colinérgicas se extraen y se aíslan de la lombriz redonda C.elegans para estudios ex vivo posteriores. El gen unc-17 se expresa en todo el cuerpo de C.elegans, y codifica para un transportador de transmembrana de acetilcolina vesicular. La expresión de este gen se puede observar en la cabeza, el cuerpo medio, y las neuronas de cola, y las proyecciones de neuronas.
Aquí se muestran micrografías representativas de fluorescencia representativas de las neuronas unc-17:GFP positivas después del aislamiento, así como un control negativo respectivo de animales salvajes N2 no modificados. Las células aisladas pueden permanecer vivas hasta tres días cuando se complementan con L-15 medio de Leibovitz y 10%FBS. Aquí se muestran datos representativos de qPCR de neuronas colinérgicas que expresan GFP, así como células musculares que expresan GFP.
Después de clasificar con éxito las células, el ARN se aísla a través de un método de isotiocianato de fenol y guanidina, después de lo cual se produjo el ADNr utilizando un kit de síntesis. Expresión de genes específicos de la neurona colinérgica, tph-1, una hidroxilasa triptófano, y snb-1, un transportador de vesículas sinápticas, se eleva en unc-17:GFP células aisladas. Sin embargo, esta expresión no está presente en las células aisladas de myo-3:GFP.
Lo inverso es cierto con la expresión de la transcripción de cadena pesada de miosina específica del músculo de myo-2, ya que la expresión de este gen se limita a las células musculares aisladas, pero no a las células colinérgicas aisladas. Es importante incubar los gusanos completamente. Sin embargo, la incubación prolongada de la cutícula del gusano puede resultar en la muerte del gusano o estrés adicional para el animal.
Después del aislamiento, las células pueden ser cultivadas durante un período de tiempo, o utilizar para el aislamiento de ARN y el análisis qRT-PCR. Las neuronas cultivadas se pueden analizar más a fondo mediante mediciones de electroforesis de abrazadera de parche. Esta técnica podría facilitar el análisis ex vivo de grupos específicos de células, ayudando así a mejorar nuestra comprensión de las respuestas específicas de las células en el contexto de organismos multicelulares en varias etapas de su ciclo de vida.
Como los productos químicos como SDS y TDT se utilizan durante este experimento, se deben seguir los procedimientos generales de seguridad de laboratorio durante la fabricación y el uso de tampones.
