秀丽隐杆线虫肠的手部解剖

手工解剖这种秀丽隐杆线虫的肠道是一种强大而简单的技术，可以通过分离细胞特异性群体中的组织来研究后生物学的各个方面。这种精细的组织解剖技术易于执行，并利用标准实验室设备，使其成为许多人常用且易于使用的方法。首先使用拔针器将 4 英寸长、外径 1.2 毫米的标准玻璃毛细管拉成注射针形状。

准备至少5个50和100微米微毛细管移液器。使用微锻造将微毛细管移液器锻造至50微米或100微米，分别在5X物镜下刻出3或5个刻度线。然后将微毛细管移液管贴在口吸气管上。

通过在直径为35毫米的无菌培养皿中加入2毫升M9和向另一个直径为35毫米的无菌培养皿中加入2毫升解剖缓冲液，准备一个M9浴和一个解剖缓冲浴。最后，向每次浴中加入100微升工作牛血清白蛋白或BSA溶液，并通过旋转混合。为了制备解剖阵列，向两个孔凹面载玻片的第一个孔中加入150微升工作左旋咪唑溶液，向第二个孔中加入150微升解剖缓冲液。

向每个孔中加入20微升工作BSA溶液。要手动解剖秀丽隐杆线虫CL2122蠕虫肠，请使用蠕虫镐将20条成虫从线虫生长培养基或NGM板移动到M9浴中。然后将所有 20 条蠕虫从 M9 浴槽移动到解剖缓冲浴中。

接下来将10个蠕虫批次从解剖缓冲浴中移动到含有左旋咪唑溶液的孔中。一旦蠕虫运动减慢，迅速将它们从左旋咪唑孔移动到包含解剖缓冲液的孔中。在开始解剖之前，让蠕虫开始在解剖缓冲液中移动一点。

在荧光解剖镜下，使用皮下注射针在咽部后面或直肠前方切开一个，以产生相同数量的肠前中半部分和中后半部分。在等待肠道最大限度地从体内挤出约一分钟时，向孔中加入50微升螯合缓冲液，以帮助减少RNA降解。为了便于肠道挤出，请使用连接到口吸引器的100微米微毛细管移液器，并将蠕虫吸入和拉出移液器。

一旦肠道充分挤出，请使用 27 号皮下注射针将其从身体其他部位和任何剩余的性腺中切断。使用微量毛细管移液器吸出肠道部分，并将其转移到含有核酸分离试剂的微量离心管中。将分离的肠保持在冰上，并对剩余的肠重复该过程。

该方法证明了肠道的成功解剖和分离。该方法还报告了从分离的肠道中分离RNA和微生物监测。由于CL2122蠕虫体内含有与GFP融合的肠道特异性金属启动子，在荧光解剖镜下观察到肠道呈绿色辉光。

成虫的解剖在咽部后面做一个初级切口后显示出挤出的肠。成功解剖肠道段似乎没有可见污染物，例如性腺或尸体的碎片。相反，不成功的解剖显示附着在肠段上的性腺和胴体。

手部解剖的RNA产量更有效，因为60个总肠切片的最终样品产生了大约15纳克的高质量总RNA。蠕虫分解和肠道细胞的FACS分离效率较低，因为它们需要数十万个肠道细胞才能获得相应数量的总RNA。使用泛细菌检测测定法进行的总微生物基因组 DNA 扩增显示，来自前、中、中、中后区域的 40 个总肠切片的最终样本产生了低但可检测的总微生物 DNA 约 0.009 皮克。

执行此过程时要记住的最重要的事情是在解剖前不要过度麻痹蠕虫，因为这会抑制最大的肠道挤出。