Dieses Protokoll ermöglicht die nahtlose Isolierung, Kultivierung und Abfrage von Transkriptionsreaktionen in einer bestimmten Zelllinie von C.elegans. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die hohe Anpassungsfähigkeit an verschiedene Lebensstadien von Würmern oder bestimmten zellspezifischen Zu isolierten Zelltypen. Demonstrieren das Verfahren werden ich und Nataliya Zahayko, eine Technikerin aus unserem Labor.
Nach dem Sammeln der Tiere zentrieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1600 mal g. Entfernen Sie alle Überstand und setzen Sie die Würmer in einem Milliliter M9-Medien wieder aus. Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.
Zentrifuge bei 1600 mal g für fünf Minuten, um die Würmer zu pellet. Dann 200 Mikroliter SDS-DTT-Puffer hinzufügen und bei Raumtemperatur fünf Minuten brüten. Die Würmer sollten nun am Körper gefaltet erscheinen, wenn sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden.
Als nächstes fügen Sie 800 Mikroliter eiskalten Isolationspuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie das Rohr sanft flicken. Zentrifuge bei 13.000 mal g und bei vier Grad Celsius für eine Minute, um die Würmer zu pellet. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit einem Milliliter Isolationspuffer.
Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Waschvorgang insgesamt fünfmal, und stellen Sie sicher, dass Der Isolationspuffer jedes Mal sorgfältig entfernt wird. Danach 100 Mikroliter Protease-Mischung aus Streptomyces griseus, gelöst im Isolationspuffer, in das Pellet geben. Bei Raumtemperatur 10 bis 15 Minuten inkubieren, um mechanische Störungen anzuwenden, indem Sie 60 bis 70 Mal mit einer 200-Mikroliter-Mikropipette-Spitze gegen den Boden des Rohres auf und ab pfeifen.
Um das Stadium der Verdauung zu bestimmen, entfernen Sie ein bis fünf Mikroliter der Verdauungsmischung, lassen Sie es auf eine Glasrutsche fallen und inspizieren Sie es mit einem Gewebekulturmikroskop. Nach fünf bis sieben Minuten sollten Wurmfragmente eine sichtbar reduzierte Nagelhaut haben und eine Gülle von Zellen wird leicht sichtbar sein. Halten Sie die Reaktion durch Zugabe von 900 Mikroliter n. B. des handelsüblichen Leibovitz-Mediums L-15, ergänzt durch 10%FBS und Penicillin-Streptomycin.
Zentrifugieren Bei 10.000 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um isolierte Fragmente und Zellen zu pellet. Waschen Sie die pelletierten Zellen zweimal mit kalten L-15 ergänzten Medien mit einem Milliliter Medien pro Wäsche. Setzen Sie die pelletierten Zellen in einem Milliliter L-15 ergänztMedien, und lassen Sie auf Eis für 30 Minuten.
Nehmen Sie dann die oberste Schicht, die etwa 700 bis 800 Mikroliter beträgt, und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenrohr. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder Einmagmactometer, um die Zelldichte von 10 bis 25 Mikroliter isolierter Zellen zu messen. Zentrifugenzellen aus der isolierten Zellsuspension bei 10 000 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die pelletierten Zellen in L-15 auf eine Zelldichte von nicht mehr als sechs Millionen Zellen pro Milliliter auf, um eine Überlastung des Durchflusszytometers zu vermeiden. Sortieren Sie dann Zellen nach GFP-positiver Expression mithilfe eines Durchflusszytometers, das Proben sortieren kann. GFP-negative Zellen können als Steuerelement für nicht zelltypspezifische Analysen verwendet werden.
Danach die isolierten Zellen in die Brunnen einer sterilen Sechs-Brunnen-Platte geben, die Platte in einen Kunststoffbehälter geben, ein feuchtes Wisch- oder Weichteilpapier hinzufügen, um den Zellen Feuchtigkeit zu verleihen, und bei 20 Grad Celsius brüten. Zentrifugenzellen aus der isolierten Zellsuspension in einem 1,5-Milliliter-RNase-freien Mikrozentrifugenrohr bei 10 000 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Mit einer Mikropipette, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter M9 Medium, um das L-15 ergänztmedium zu waschen.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 10.000 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Wasch- und Zentrifugationsprozess dreimal insgesamt, um sicherzustellen, dass alle Medien entfernt werden, und stellen Sie sicher, dass Sie den Überstand jedes Mal sorgfältig entfernen. Dann fügen Sie einen Milliliter Phenol und Guanidin Isothiocyanat Lösung zu den Zellen und Pipette die Suspension auf und ab sorgfältig.
Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Danach 250 Mikroliter Chloroform hinzufügen und das Rohr 15 bis 20 Mal sanft invertieren. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren.
Zentrifuge bei 10.000 mal g und bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um so viel wie möglich von der oberen wässrigen Schicht sorgfältig zu entfernen, um sicherzustellen, dass die unteren organischen Schichten nicht stören. Übertragen Sie die untere Schicht in ein neues 1,5 Milliliter RNase-freies Mikrozentrifugenrohr.
Zum neuen Rohr 500 Mikroliter Isopropanol hinzufügen und durch Invertieren des Rohres mischen. Inkubieren Sie diese Lösung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 14.000 mal g und bei 25 Grad Celsius für 20 Minuten.
Legen Sie die Proben auf Eis und verwenden Sie eine Mikropipette, um so viel Isopropanol wie möglich zu entfernen. Fügen Sie dem Rohr vorsichtig einen Milliliter 70% Ethanol in RNase-freies doppeldestilliertes Wasser in das Rohr, indem Sie es auf die Seite des Rohres auftragen. Zentrifuge bei 10.000 mal g und bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten.
Entfernen Sie den größten Teil des Ethanols und lassen Sie die Röhre drei bis fünf Minuten auf Eis trocknen. Danach 15 bis 20 Mikroliter RNase-freies doppeldestilliertes Wasser hinzufügen. Verwenden Sie ein Spektralphotometer mit 260 Nanometern, um die RNA-Konzentration und -Reinheit zu messen.
In dieser Studie werden unc-17:GFP-positive cholinerge Neuronen extrahiert und aus dem Rundwurm C.elegans für nachfolgende Ex-vivo-Studien isoliert. Das Unc-17-Gen wird im gesamten C.elegans-Körper exprimiert und kodiert für einen vesikulären Acetylcholin-Transmembrantransporter. Die Expression dieses Gens kann in Kopf-, Mittelkörper- und Schwanzneuronen und Neuronen-Projektionen beobachtet werden.
Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Mikroskope von unc-17:GFP-positiven Neuronen nach Isolation sowie eine entsprechende Negativkontrolle von unveränderten N2-Wildtieren werden hier gezeigt. Isolierte Zellen können bis zu drei Tage am Leben bleiben, wenn sie mit Leibovitz' L-15 Medium und 10% FBS ergänzt werden. Repräsentative Daten von qPCR aus GFP-exezisenden cholinergen Neuronen sowie GFP-exemitten Muskelzellen werden hier gezeigt.
Nach erfolgreicher Sortierung von Zellen wird die RNA über eine Phenol- und Guanidin-Isothiocyanat-Methode isoliert, nach der cDNA mit einem Synthesekit hergestellt wurde. Die Expression cholinergen neuronspezifischer Gene, tph-1, einer Tryptophan-Hydroxylase und snb-1, einem synaptischen Vesikeltransporter, ist in unc-17:GFP-isolierten Zellen erhöht. Dieser Ausdruck ist jedoch in myo-3:GFP isolierten Zellen nicht vorhanden.
Das Gegenteil gilt für die Expression der muskelspezifischen myosinlastigen Kettentranskripts von Myo-2, da die Expression dieses Gens auf isolierte Muskelzellen beschränkt ist, nicht aber auf die isolierten cholinergen Zellen. Es ist wichtig, die Würmer vollständig zu bebrüten. Eine längere Inkubation der Wurmhaut kann jedoch zum Wurmtod oder zu zusätzlichem Stress für das Tier führen.
Nach der Isolierung können die Zellen entweder für einen bestimmten Zeitraum kultiviert oder für die RNA-Isolation und qRT-PCR-Analyse verwendet werden. Kultivierte Neuronen können durch Patchclamp-Elektrophoresemessungen weiter analysiert werden. Diese Technik könnte die Ex-vivo-Analyse bestimmter Zellgruppen erleichtern und so dazu beitragen, unser Verständnis zellspezifischer Reaktionen im Kontext multizellulärer Organismen in verschiedenen Phasen ihres Lebenszyklus zu verbessern.
Da bei diesem Experiment Chemikalien wie SDS und DTT verwendet werden, sollten allgemeine Laborsicherheitsverfahren bei der Herstellung und Verwendung von Puffern befolgt werden.
