このプロトコルは、C.elegansからの特定の細胞系統における転写応答のシームレスな分離、培養、および尋問を可能にする。このプロトコルの主な利点は、分離するワームまたは特定の細胞タイプの異なるライフステージへの適応性の高いレベルです。この手順を実証することは、私と私たちの研究室の技術者であるナタリヤ・ザハイコです。
動物を採取した後、5分間1600倍gで遠心分離する。上清をすべて取り除き、M9メディアの1ミリリットルでワームを再中断します。懸濁液を1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。
1600回gで遠心分離機を5分間ペレット化し、ワームをペレット化する。その後、200マイクロリットルのSDS-DTTバッファーを加え、室温で5分間インキュベートします。光顕微鏡で見ると、ワームは体に沿ってしわになっているように見えるはずです。
次に、800マイクロリットルの氷冷分離バッファーを加え、チューブを軽くフリックして混ぜます。13,000倍gで遠心分離機、4度で1分間ワームをペレットします。上清を取り除き、1ミリリットルの分離バッファーで洗います。
遠心分離を繰り返し、洗浄プロセスを合計5回、毎回分離バッファーを慎重に取り除きます。この後、ストレプトマイセス・グリセウスから100マイクロリットルのプロテアーゼ混合物を添加し、分離緩衝液に溶解し、ペレットに加える。室温で10〜15分間インキュベートし、チューブの底部に対して200マイクロピペットチップで60〜70回上下にピペットを入れ、機械的破壊を適用することを確認します。
消化の段階を決定するには、消化混合物の1〜5マイクロリットルを取り除き、ガラススライドに落とし、組織培養顕微鏡を使用して検査します。5〜7分後、ワーム断片は目に見えてキューティクルを減少させ、細胞のスラリーが容易に見えるはずです。10%FBSおよびペニシリンストレプトマイシンを添加した、市販のライボヴィッツのL-15培地の900マイクロリットルを添加することによって反応を停止する。
遠心分離機は10,000倍gで、4度で5分間、単離した断片および細胞をペレットにする。ペレット化された細胞を、1回の洗浄につき1ミリリットルの培地を使用して、冷たいL-15補充培地でさらに2回洗浄します。ペレット化された細胞をL-15補充培地の1ミリリットルで再懸濁し、氷の上に30分間放置する。
その後、約700〜800マイクロリットルの最上層を取り、マイクロ遠心チューブに移します。自動化された細胞カウンターまたはマシトメーターを使用して、単離された細胞の10〜25マイクロリットルの細胞密度を測定します。分離細胞懸濁液から遠心分離細胞を10,000 gで、摂氏4度で5分間培養した。
上清を捨て、フローサイトメーターの過負荷を避けるために、L-15補充培地中のペレット化細胞を1ミリリットル当たり600万個以下の細胞密度に再懸濁します。次いで、サンプルを選別し得るフローサイトメーターを用いてGFP陽性発現により細胞を並べ替える。GFP陰性細胞は、非細胞型特異的解析のコントロールとして使用できます。
この後、単離した細胞を無菌の6ウェルプレートの井戸にプレートし、プレートをプラスチック容器に入れ、湿ったワイプまたは柔らかいティッシュペーパーを加えて細胞に水分を加え、摂氏20度でインキュベートします。10,000グラムのRNaseフリーマイクロ遠心分離チューブ内の単離された細胞懸濁液からの遠心分離細胞と摂氏4度で5分間。マイクロピペットを使用して上清を取り除き、100マイクロリットルのM9培地を加え、L-15補充培地を洗い流します。
次に、細胞を10,000倍gで5分間摂氏4度で遠心分離し、上清を取り除きます。この洗浄と遠心分離プロセスを合計3回繰り返して、すべての媒体が取り除かれるようにし、毎回上清を慎重に取り除きます。次に、フェノールとグアニジンイソチオシアネート溶液を1ミリリットル加え、懸濁液を上下にピペットして慎重に添加する。
混合物を室温で5分間インキュベートする。この後、250マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを15~20回軽く反転します。室温で5分間インキュベートします。
10,000倍gの遠心分離機と摂氏25度で5分間。マイクロピペットを使用して、最上部の水層をできるだけ慎重に取り除き、底部の有機層を乱さないようにします。底層を新しい1.5ミリリットルRNaseフリーマイクロ遠心分離チューブに移します。
新しいチューブに、イソプロパノールの500マイクロリットルを追加し、チューブを反転させることによって混合します。この溶液を室温で5分間インキュベートします。その後、チューブを14,000倍g、摂氏25度で20分間遠心分離します。
サンプルを氷の上に置き、マイクロピペットを使用してできるだけ多くのイソプロパノールを取り除きます。チューブの側面に塗布して、RNaseフリーの二重蒸留水に70%エタノールを1ミリリットル加えてチューブに加えます。10,000倍gの遠心分離機と摂氏25度で5分間。
エタノールの大部分を取り除き、チューブを氷の上で3〜5分間空気乾燥させます。この後、RNaseフリーの二重蒸留水を15~20マイクロリットル加えます。260ナノメートルの分光光度計を使用して、RNA濃度と純度を測定します。
この研究では、unc-17:GFP陽性コリン作動性ニューロンが抽出され、その後のex vivo研究のために回虫C.elegansから単離される。unc-17遺伝子は、C.elegans本体全体に発現し、静脈アセチルコリン膜貫通トランスポーターのコードを示す。この遺伝子の発現は、頭、中身、尾神経、およびニューロンの突起で観察することができる。
単離後のunc-17:GFP陽性ニューロンの代表的な蛍光顕微鏡写真、ならびに未改変N2型動物からのそれぞれの陰性対照を示す。孤立した細胞は、ライボヴィッツのL-15培地および10%FBSを補充すると、最大3日間生き続けることができます。GFP発現コリン作動性ニューロンからのqPCRの代表的なデータは、GFP発現筋細胞と同様に、ここに示されている。
細胞の選別に成功した後、RNAはフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法を介して単離され、その後、cDNAは合成キットを用いて産生された。コリン作動性ニューロン特異的遺伝子の発現は、tph-1、トリプトファンヒドロキシラーゼ、およびシナプス性小胞輸送体であるsnb-1が、単離した17:GFP細胞において上昇する。しかし、この発現はmyo-3:GFP単離細胞には存在しない。
この遺伝子の発現は単離された筋肉細胞に限定されるが、単離されたコリン作動性細胞に限定されるので、筋特異的なミオシン重鎖転写産物の発現に対して逆が当てはまる。ワームを完全にインキュベートすることが重要です。しかし、ワームキューティクルの拡張インキュベーションは、ワーム死または動物への追加のストレスをもたらす可能性があります。
分離後、細胞は一定期間培養するか、RNAの単離およびqRT-PCR分析に使用することができます。培養ニューロンは、パッチクランプ電気泳動測定により更に解析することができる。この技術は、細胞の特定のグループのex vivo分析を容易にし、それによって、そのライフサイクルの様々な段階で多細胞生物の文脈における細胞特異的応答の理解を深めるのに役立つ可能性があります。
この実験ではSDSやDTTなどの化学物質を使用するので、バッファの作成や使用時には一般的なラボの安全手順に従う必要があります。
