使用路西法黄电磷学可视化星形形态

这种方法可用于促进非常精细的星细胞过程的可视化，用于评估疾病和稳定状态期间突触的星细胞神经元相互作用。此技术也可以应用于任何小鼠模型、细胞群体或大脑区域。要准备具有适当电阻的锐电极，请用微管拉拔器上的灯丝拉拔硅酸盐玻璃单筒电极。

将拉拔的电极存放在封闭的容器中，以防止灰尘进入尖端，并保持电极从箱底升高，以防止尖端断裂。要用荧光笔黄色染料溶液填充电极，请将电极放在垂直位置，尖端朝下，将一到两个微升荧光笔黄色溶液移液器插入电极背面。等待 5 到 10 分钟，让溶液通过毛细管作用移动到尖端，然后轻轻地将填充电极固定到连接到操纵器的电极支架中，电极支架的银线与电极内的荧光素黄色接触。

对于染料喷射测试，轻轻地将一个轻轻固定的大脑切片放入一个玻璃底部盘，在室温下装满0.1摩尔PBS，用带尼龙弦的铂琴将切片固定到位。将电极连接到电压源，将接地电极放入包含脑片的浴缸中。将共体显微镜的目标移动到感兴趣的大脑区域，并使用 10X 水浸透镜将电极降入溶液中，将电极移动到视场中心。

在亮场照明下，使用 40X 水浸透镜仔细检查电极，以确保电极清晰无碎屑或气泡。使用 488 纳米激光切换到共声激光扫描显微镜。以 12 伏打开刺激器以测试染料喷射。

较大的荧光染料云应可见在电极的尖端。然后，在亮场下缓慢地将电极朝向切片，停在表面上方。要用离子磷填充感兴趣的星形细胞，请使用红外差分干扰对比度来识别直径约 10 微米的细长椭圆形索玛塔的星形细胞，在切片表面以下 40 到 50 微米。

这是海马的地层半径，正下方是金字塔细胞层。当我们通过组织移动时，我们可以看到血管、神经元、星细胞和其他细胞类型。选择星细胞后，将细胞移动到视场中心，然后缓慢地将电极尖端降低到切片中，在组织中导航，直到电极与细胞体位于同一平原上。

一旦星形细胞的细胞体清晰可见并勾勒出轮廓，缓慢而轻轻地向前推进电极，移动电极，直到尖端刺穿细胞的索马。缓慢地上下移动目标的焦点，以注意电极是否位于索马内。电极尖端进入电池内后，以 0.5 至 1 伏打开刺激器，以连续将电流喷射到电池中。

使用共体显微镜观看细胞膜，增加数字变焦以可视化细胞的细节，并确保电极的尖端在细胞内可见。等待约 15 分钟，直到更精细的分支和过程出现定义，然后关闭电压，轻轻地从电池中退出电极尖端。要对填充的细胞进行成像，请等待 15 到 20 分钟，让细胞返回到原始形式，然后调整共合显微镜上的设置，以确保在 40 倍目标下出现更精细的分支和过程。

设置步长为 0.3 微米的 Z 堆栈，在成像时移动目标，直到没有来自单元的信号，然后将该步骤设置为顶部。然后向下移动目标，对焦穿过单元格，直到没有信号，然后将该步骤设置为底部。成像完成后，检查电极有无染料弹出。

如果出现大型染料云，电极可用于下一片。否则，更换电极。通过生成最大强度投影，可以观察到其域中星细胞结构的详细视图。

四 X 级放大到星细胞显示一个主要分支、几个次要分支的最大强度投影，以及周围分支和传单的分布。此处显示 CA1 星细胞的原始图像。在这些后续图像中重建由星形细胞所包围的细胞体、主要分支、过程和领土体积。

重建后，对索马、整个细胞和领土的体积进行量化。并且统计了主要分支机构的数量。作为标记中间星细胞纤维丝的细胞骨骼蛋白在细胞索马、主要分支和一些二级星细胞分支中表达，但不是在更精细的分支和工艺中。

在这项具有代表性的分析中，没有发现由胶质纤维酸蛋白标记的原枝数和由荧光素黄色标记的原枝数量有显著差异。此外，由胶质纤维酸蛋白标记的星细胞的细胞面积和体积明显小于该区域，体积以荧光素黄色可视化，表明胶质纤维酸蛋白是标记主要分支的可靠标记，但对确定细胞的整体面积或体积没有用。从电极尖端释放的染料量取决于电极电阻，电极电阻必须足够高，才能使稳定的染料流被喷射。

未来的研究可以通过超分辨率光显微镜或免疫组织化学分析星细胞结构中特定蛋白质的表达来研究星细胞结构的不同成分。