Este método se puede utilizar para facilitar la visualización de procesos de astrocitos muy finos para la evaluación de interacciones neuronales de astrocitos en la sinapsis durante la enfermedad y estados estables. Esta técnica también se puede aplicar en cualquier modelo de ratón, población celular o región cerebral. Para preparar un electrodo afilado con una resistencia adecuada, tire de un electrodo de barril único de vidrio borosilicato con un filamento en un tirador de micropipetas.
Guarde los electrodos tirados en un recipiente cerrado para evitar que el polvo entre en las puntas y mantenga los electrodos elevados desde la parte inferior de la caja para evitar que las puntas se rompan. Para llenar un electrodo con solución de tinte amarillo lucifer, coloque un electrodo en la posición vertical con la punta hacia abajo, y pipetee de uno a dos microlitros de solución amarilla lucifer en la parte posterior del electrodo. Espere de cinco a 10 minutos para que la solución se mueva a la punta a través de la acción capilar antes de asegurar suavemente el electrodo lleno en un soporte de electrodo conectado a un manipulador con el cable de plata del soporte del electrodo en contacto con el amarillo lucifer dentro del electrodo.
Para la prueba de eyección de tinte, coloque suavemente una rebanada de cerebro ligeramente fija en un plato de fondo de vidrio lleno de 0.1 MOLar PBS a temperatura ambiente y mantenga la rebanada en su lugar con un arpa de platino con cuerdas de nylon. Conecte el electrodo a una fuente de tensión y coloque el electrodo de tierra en el baño que contiene la rebanada cerebral. Mueva el objetivo de un microscopio confocal a la región cerebral de interés y baje el electrodo a la solución utilizando la lente de inmersión de agua 10X, moviendo el electrodo al centro del campo de visión.
Bajo iluminación de campo brillante, examine el electrodo cuidadosamente con la lente de inmersión en agua 40X para asegurarse de que el electrodo parezca transparente y sin residuos ni burbujas. Cambie a la microscopía de escaneo láser confocal con un láser de 488 nanómetros. Encienda el estimulador a 12 voltios para probar la eyección del tinte.
Una gran nube de colorante fluorescente debe ser visible alrededor de la punta del electrodo. Luego, debajo del campo brillante, baje lentamente el electrodo hacia la rebanada, deteniéndose justo por encima de la superficie. Para llenar un astrocito de interés con iontoforesis, utilice el contraste de interferencia diferencial infrarroja para identificar astrocitos con somatas alargadas de forma ovalada de unos 10 micrómetros de diámetro, de 40 a 50 micrómetros por debajo de la superficie de la rebanada.
Este es el estrato radiatum del hipocampo directamente debajo de la capa celular piramidal. A medida que nos movemos a través del tejido, podemos ver vasos sanguíneos, neuronas, astrocitos y otros tipos celulares. Una vez que se ha seleccionado un astrocito, mueva la celda al centro del campo de visión y baje lentamente la punta del electrodo en la rebanada, navegando a través del tejido hasta que el electrodo esté en la misma llanura que el cuerpo celular.
Una vez que el cuerpo celular del astrocito es claramente visible y esbozado, avance lenta y suavemente el electrodo hacia adelante, moviendo el electrodo hasta que la punta empale el soma de la célula. Mueva el foco del objetivo lentamente hacia arriba y hacia abajo para observar si el electrodo está dentro del soma. Una vez que la punta del electrodo está dentro de la célula, encienda el estimulador en 0.5 a uno voltios para expulsar continuamente la corriente en la célula.
Usando el microscopio confocal, vea la película celular, aumentando el zoom digital para visualizar los detalles de la célula y para asegurarse de que la punta del electrodo es visible dentro de la célula según sea necesario. Espere unos 15 minutos hasta que las ramas y los procesos más finos aparezcan definidos antes de apagar la tensión y retirar suavemente la punta del electrodo de la célula. Para crear una imagen de la celda rellena, espere de 15 a 20 minutos para que la célula vuelva a su forma original antes de ajustar el ajuste en el microscopio confocal para asegurarse de que las ramas y procesos más finos aparecen definidos bajo el objetivo 40X.
Configure una pila Z con un tamaño de paso de 0,3 micrómetros, moviendo el objetivo durante la toma de imágenes hasta que no haya señal de la celda y establezca ese paso como la parte superior. A continuación, mueva el objetivo hacia abajo, centrándose a través de la celda hasta que no haya señal y establezca ese paso como la parte inferior. Una vez completada la toma de imágenes, compruebe si el electrodo está en busca de eyección de tinte.
Si aparece una nube de tinte grande, el electrodo se puede utilizar para la siguiente rebanada. De lo contrario, sustituya el electrodo. Al generar una proyección de intensidad máxima, se puede observar una vista detallada de la estructura de un astrocito en su dominio.
Un zoom de cuatro X magnitud en el astrocito revela una proyección de intensidad máxima de una rama principal, varias ramas secundarias y la distribución de las ramillas y foliolos circundantes. Aquí, se muestra la imagen original de un astrocito CA1. El cuerpo celular, las ramas principales, los procesos y el volumen del territorio encerrados por el astrocito se reconstruyen en estas imágenes posteriores.
Después de que se crearon las reconstrucciones, se cuantificaron los volúmenes del soma, toda la célula y el territorio. Y el número de ramas principales fueron contadas. Como proteína citoesquelética que etiqueta filamentos astrocitos intermedios se expresa en el soma celular, ramas principales, y algunas ramas secundarias de astrocitos, pero no en las ramas y procesos más finos.
En este análisis representativo, no se encontraron diferencias significativas en el número de ramas primarias etiquetadas por proteína ácida fibrilaria glial y las visualizadas por amarillo lucifer. Además, el área celular y el volumen del astrocito etiquetado por proteína ácida fibrilacionaria glial fueron significativamente más pequeños que el área y el volumen visualizado con amarillo lucifer, lo que demuestra que la proteína ácida fibrilaria glial es un marcador confiable para etiquetar las principales ramas, pero no es útil para determinar el área general o el volumen de la célula. La cantidad de tinte liberado de la punta del electrodo depende de la resistencia del electrodo que debe ser lo suficientemente alta como para permitir que se expulse un flujo constante de tinte.
Estudios futuros pueden examinar los diferentes componentes de la estructura de astrocitos mediante microscopía de luz de superrescencia o mediante un análisis inmunohistoquímico de la expresión de proteínas específicas dentro de la estructura de los astrocitos.
