Cette méthode peut être utilisée pour faciliter la visualisation de processus d’astrocytes très fins pour l’évaluation des interactions neuronales des astrocytes à la synapse pendant la maladie et les états stables. Cette technique peut également être appliquée dans n’importe quel modèle de souris, population cellulaire, ou région du cerveau. Pour préparer une électrode tranchante avec une résistance appropriée, tirez une électrode en verre borosilicate à canon unique avec un filament sur un pull de micropipette.
Rangez les électrodes tirées dans un récipient fermé pour empêcher la poussière d’entrer dans les extrémités et gardez les électrodes élevées du fond de la boîte pour empêcher les pointes de se briser. Pour remplir une électrode de solution de colorant jaune lucifer, placez une électrode en position verticale avec la pointe orientée vers le bas, et pipette un à deux microlitres de solution jaune lucifer à l’arrière de l’électrode. Attendez cinq à dix minutes pour que la solution se déplace vers la pointe par action capillaire avant de fixer doucement l’électrode remplie dans un support d’électrode relié à un manipulateur avec le fil d’argent du support d’électrode en contact avec le jaune lucifer à l’intérieur de l’électrode.
Pour l’essai d’éjection de colorant, placez doucement une tranche légèrement fixe de cerveau dans un plat inférieur en verre rempli de PBS molaire de 0,1 à température ambiante et maintenez la tranche en place avec une harpe platine avec des cordes de nylon. Connectez l’électrode à une source de tension et placez l’électrode au sol dans le bain contenant la tranche du cerveau. Déplacez l’objectif d’un microscope confocal vers la région du cerveau d’intérêt et abaissez l’électrode dans la solution à l’aide de la lentille d’immersion d’eau 10X, déplaçant l’électrode au centre du champ de vision.
Sous l’éclairage du champ lumineux, examinez attentivement l’électrode à l’aide de la lentille d’immersion d’eau 40X pour vous assurer que l’électrode semble claire et sans débris ni bulles. Passez à la microscopie à balayage laser confoccal avec un laser de 488 nanomètres. Allumez le stimulateur à 12 volts pour tester l’éjection de colorant.
Un gros nuage de colorant fluorescent doit être visible autour de la pointe de l’électrode. Puis, sous le champ lumineux lentement abaisser l’électrode vers la tranche, s’arrêtant juste au-dessus de la surface. Pour remplir un astrocyte d’intérêt avec l’iontophoresis, utilisez le contraste infrarouge d’interférence différentielle pour identifier les astrocytes avec somata ovale allongé d’environ 10 micromètres de diamètre, 40 à 50 micromètres sous la surface de la tranche.
C’est le radiatum stratique de l’hippocampe directement en dessous de la couche cellulaire pyramidale. Comme nous nous déplaçons à travers les tissus, nous pouvons voir les vaisseaux sanguins, les neurones, les astrocytes, et d’autres types de cellules. Une fois qu’un astrocyte a été sélectionné, déplacez la cellule au centre du champ de vision et abaissez lentement la pointe de l’électrode dans la tranche, naviguant à travers le tissu jusqu’à ce que l’électrode soit sur la même plaine que le corps cellulaire.
Une fois que le corps cellulaire de l’astrocyte est clairement visible et décrit, avancez lentement et doucement l’électrode vers l’avant, déplaçant l’électrode jusqu’à ce que la pointe empale le soma de la cellule. Déplacez l’objectif lentement de haut en bas pour noter si l’électrode est à l’intérieur du soma. Une fois que la pointe de l’électrode est à l’intérieur de la cellule, allumez le stimulateur à 0,5 à un volts pour éjecter continuellement le courant dans la cellule.
À l’aide du microscope confocal, regardez le film cellulaire, augmentant le zoom numérique pour visualiser les détails de la cellule et pour vous assurer que la pointe de l’électrode est visible à l’intérieur de la cellule si nécessaire. Attendez environ 15 minutes jusqu’à ce que les branches et les processus plus fins apparaissent définis avant d’éteindre la tension et de retirer doucement la pointe de l’électrode de la cellule. Pour imager la cellule remplie, attendez de 15 à 20 minutes que la cellule revienne à sa forme originale avant d’ajuster le réglage du microscope confocal pour s’assurer que les branches et les processus plus fins semblent définis sous l’objectif 40X.
Configurez une pile Z avec une taille d’étape de 0,3 micromètre, déplaçant l’objectif pendant l’imagerie jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de signal de la cellule et définissez cette étape comme le haut. Déplacez ensuite l’objectif vers le bas, en se concentrant à travers la cellule jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de signal et définissez cette étape comme le fond. Une fois l’imagerie terminée, vérifiez l’électrode pour l’éjection de teinture.
Si un gros nuage de colorant apparaît, l’électrode peut être utilisée pour la tranche suivante. Sinon, remplacez l’électrode. En générant une projection d’intensité maximale, une vue détaillée de la structure d’un astrocyte dans son domaine peut être observée.
Un zoom de magnitude quatre X sur l’astrocyte révèle une projection d’intensité maximale d’une branche majeure, plusieurs branches secondaires, et la distribution des branchettes et des folioles environnantes. Ici, l’image originale d’un astrocyte CA1 est affichée. Le corps cellulaire, les branches principales, les processus et le volume du territoire inclus par l’astrocyte sont reconstruits dans ces images ultérieures.
Après la création des reconstructions, les volumes du soma, de la cellule entière et du territoire ont été quantifiés. Et le nombre de succursales principales a été compté. Comme protéine cytosquelettique qui étiquette les filaments intermédiaires d’astrocyte est exprimée dans le soma cellulaire, les branches principales, et quelques branches secondaires d’astrocyte, mais pas dans les branches et les processus plus fins.
Dans cette analyse représentative, aucune différence significative n’a été trouvée dans le nombre de branches primaires étiquetées par protéine acide fibrillaire gliale et celles visualisent par le jaune lucifer. En outre, la zone cellulaire et le volume de l’astrocyte étiquetés par protéine acide fibrillaire gliale étaient significativement plus petits que la zone et le volume visualisés avec le jaune lucifer, démontrant que la protéine acide fibrillaire gliale est un marqueur fiable pour l’étiquetage des branches principales, mais n’est pas utile pour déterminer la zone globale ou le volume de la cellule. La quantité de colorant libérée par la pointe de l’électrode dépend de la résistance aux électrodes qui doit être suffisamment élevée pour permettre l’éjecter d’un flux régulier de colorant.
Les études futures peuvent examiner les différents composants de la structure des astrocytes par microscopie légère à super résolution ou par analyse immunohistochimique de l’expression de protéines spécifiques dans la structure des astrocytes.
