冠状血管化后心血管预后冠状动脉祖细胞和可溶性生物标志物

虽然血管成形术帮助冠状动脉疾病患者，但心血管事件仍可能发生在手术后。由于MPC和可溶性分子是从冠状动脉循环中获得的，它们可以与血管损伤和修复的程度相关。因此，冠状MPC和可溶性中介水平可用于估计冠状动脉疾病患者的心血管事件和预后，接受冠状动脉血管成形术。

MPC 和可溶性分子也可用于估计在不同缺血环境中发生的并发症和预后，例如复发性肢体缺血性中风。演示该程序将是爱德华多·维拉-戈麦斯和亚历杭德罗·埃尔南德斯-帕特里西奥，实验室技术人员，卡伦·德拉维加-莫雷诺和卡洛斯·萨莫拉-阿莱曼，本科生。同样演示的还有科学硕士生加布里埃拉·亚历山德拉·多明格斯-佩雷斯、博士生阿尔贝托·梅尔乔-洛佩斯和科学硕士合作者马里奥·安东尼奥·泰列兹-冈萨雷斯。

在采集后的一小时内，将六毫升采集的血液样本转移到15毫升锥形管中，并在PBS中以一比一的比例稀释血液。将两毫升密度梯度介质加入三个试管，并小心地将稀释的三个等等液转移到密度梯度介质的每个管中。通过离心分离细胞，并在接口将细胞转移到新管。

将收集的细胞在两毫升PBS中清洗一次，每次洗涤6分钟，在两毫升新鲜PBS中清洗六次，每次洗涤两分钟。上次洗涤后，将含有MPC的细胞颗粒重新悬浮在PBS的一毫升中进行计数，并将1倍十添加到六个细胞中，以标记五毫升流动细胞学管。通过离心使细胞产生分裂，并加入100微升的合适抗体，稀释在抗体孵化溶液中，以每管。

将细胞与每次添加的抗体鸡尾酒轻轻混合10秒，将样品放在4摄氏度，不受光线影响，20分钟。在孵化结束时，将样品离心，重新悬浮PBS 500微升颗粒，并辅以两毫摩尔EDTA。使用等型匹配对子来设置背景染色，根据标准方案通过流式细胞学分析样品，在一个正向的侧散射图中对淋巴细胞进行浇注，以排除残余粒细胞、细胞碎片和其他颗粒。

设置一个门，以包含大量具有 CD45 阳性 CD34 阳性表型的细胞。接下来，使用CD45阳性CD34阳性门选择激酶插入域受体CD133或CD184阳性细胞。然后，MPC 子群体可以通过其特定的细胞表面标记进行标识，并报告为封闭事件的百分比。

为了确定采集的血液样本中可溶性生物标志物的浓度，首先，用套件提供的洗涤缓冲液清洗适当的预涂 ELISA 板两次，并标记标准、样品和控制管。离心血液样本分离血液成分，将血浆分块分块分入样品管中。将标准、样品和控制装置转移到适当的孔中，并在 37 摄氏度下密封并孵育板 90 分钟。

在孵化结束时，丢弃井内，将生物素检测抗体添加到每一个井中。在37摄氏度下孵育一小时后，丢弃盘子内装物，每次洗涤用新鲜洗涤缓冲液洗三次。上次洗涤后，用斯特雷普他丁工作溶液在37摄氏度下孵育样品30分钟，然后进行三次洗涤，如证明。

最后一次洗涤后，使用四甲基苯胺基质在37摄氏度下处理样品30分钟。当颜色发展时，从套件中添加停止溶液，并在微孔 ELISA 读卡器中读取光密度吸收度。要确定肿瘤坏死因子α和白细胞间-1β的浓度，使用免疫磁性多路复用，标记标准、样品和控制管，并旋转磁珠小瓶30秒。

将珠子添加到多路复用检测板的适当孔中。添加所有磁珠后，牢固插入手持式磁板垫圈，等待两分钟，让磁珠积聚在每一个井的底部，然后快速反转手持式磁板垫圈和废容器上的板组件。接下来，向每井添加 150 微升的洗涤缓冲液，等待 30 秒，让珠子积聚在底部。

再次丢弃内容，正如刚刚演示的，并添加 25 微升的通用检测缓冲液和 25 微升的已准备标准、样品和控制。密封板至少60分钟孵育，在室温下不受光线影响，每分钟旋转500次。在孵育结束时，在每井中加入150微升的洗涤缓冲液，让珠子沉淀30秒。

然后，使用板垫圈丢弃井内装物，并标注每井25微升检测抗体混合物，然后两次清洗，如证明。第二次洗涤后，用25微升的斯特雷普他丁PE孵育样品，在室温下孵育30分钟。在孵化结束时，在每口井中加入120微升的读数缓冲液，并密封板进行5分钟的孵育，在室温下不受光线影响，每分钟旋转500次。

然后，将板加载到多路复用检测读取器上，并根据每个分析器调整读数参数。从52名接受冠状动脉血管造影术的患者中采集冠状动脉、静脉鼻窦和外周血，并证明高血压和血脂异常患病率很高。大多数MPC的基线冠状动脉浓度在出现重大心血管不良事件的患者中显著降低，MPC亚细胞CD34阳性CD133阳性和CD45阳性、CD34阳性、CD133阳性、CD184阳性的降幅较大。

同样，出现重大心血管不良事件的患者在可溶性 ICAM-1 和较低量的金属蛋白 9 中增加了基线。冠状 MPC 和可溶性 ICAM-1 显示了主要心血管无不良生存的预后能力。有趣的是，肿瘤坏死因子α的表达根据测量时间和冠状动脉采样的位置，根据同一冠状动脉的不同流明区域的比较，使用血管内超声波显示变异。

在MPC分离过程中，一定要将血液转移到密度梯度上，并在离心后小心地从界面收集细胞。周期性涡流可防止珠子沉淀，使用磁板垫圈有助于在洗涤过程中将珠子留在井内。冠状 MPC 和可溶性分子可用于在血管成形术后随发过程中降低心血管事件的风险，帮助向高危人群提供二级预防，因为此技术反映了停止溶液过程中发生的病理生理过程，对于血管生物学发挥作用的条件可能很有用。