对于心肌病等新生儿疾病，使用诱导多能干细胞衍生细胞的再生疗法具有巨大的潜力。然而，体外加速细胞生长导致累积代谢物（如活性氧物种）的DNA损伤。移植这些DNA受损的细胞会导致器官的移植和再生不良。
移植前，应评估细胞的质量。在这里，我们提供两个分步协议来评估干细胞中的DNA损伤。展示这些程序的将是研究员杰西卡·米勒、研究员尼基尔·马德卡尔和实验室技术员瓦桑蒂·拉贾塞卡兰。
首先，将500毫克低熔化的阿加罗斯放在100毫升的DNA-RNA自由水中。在微波炉中加热瓶子，直到气糖溶解。然后，将瓶子放在一个37摄氏度的水浴，直到需要。
要准备预涂覆的彗星幻灯片，请将几滴0.5%的加糖放在玻璃滑梯上。立即使用盖玻片将红糖铺开，形成一层薄薄的红糖涂层。在低光条件下工作，避免紫外线引起的细胞损伤，在管中混合10微升细胞悬浮液和90微升的阿加罗斯溶液。
将管子放在37摄氏度的水浴中，以防止加糖凝固。混合溶液，不引入气泡，将移液器每个点 70 微升混合到预涂层彗星幻灯片上。使用移液器尖端，将细胞气糖混合物扩散形成薄层。
将幻灯片在摄氏四度下放置 15 分钟。在容器中，将幻灯片完全淹没在冷解液缓冲液中。将容器在四摄氏度的黑暗中放置一小时。
用冷碱性溶液更换解液。确保幻灯片完全淹没。将容器在黑暗中 4 摄氏度下再放置 30 分钟后，将幻灯片放在水平电泳罐中。
向油箱加注冷碱性电泳缓冲液，直到滑梯完全淹没。以每厘米一伏的速度施加电压 15 至 30 分钟。在容器中，将滑梯完全淹没在冰冷的去水中。
两分钟后，去除去水并加入新鲜的去维化水，然后再次重复此步骤。接下来，用冷70%乙醇代替去化水。五分钟后，轻轻取下幻灯片，不倾斜，让其干燥。
干燥后，将100微升稀释DNA染料添加到每个点，并在室温下等待15分钟。在荧光显微镜中使用 FITC 过滤器，拍摄每个样本总共 50 到 100 颗彗星的图像。培养 iPS 衍生的心肌细胞，如文本协议所述。
要在腔室幻灯片中查看 iPS 衍生的心肌细胞，请先从孔中丢弃培养基，然后用 PBS 清洗细胞三次。每井加入1毫升0.25%的三辛，并在37摄氏度下孵育5分钟。在显微镜下检查板细胞分离。
然后添加一毫升的 CMM 以停止三辛。将电池悬浮液放在15毫升管中，在4摄氏度和200倍g下离心5分钟。丢弃介质，加入一毫升的 CMM，然后重新暂停细胞。
计算细胞并调整细胞计数，在1.6毫升CMM中获取200万个细胞。现在种子200微升细胞悬浮液每井的八井室滑动。轻轻点击幻灯片，将细胞铺在井周围。
在37摄氏度下孵育细胞。对于 iPS 衍生的心肌细胞多索鲁比辛治疗，丢弃 iPS 衍生心肌细胞孔中的培养基，用 PBS 清洗细胞。在37摄氏度下用一微摩尔多索鲁比辛治疗细胞4小时。
吸气介质，用PBS清洗细胞。要进行免疫标记，用PBS清洗细胞三次，并在每井中加入200微升新鲜准备的4%半甲醛。在室温下在黑暗中固定细胞20分钟。
用PBS清洗细胞后，每井加入200微升阻滞缓冲液，在室温下在加湿室中堵塞30分钟。去除阻断缓冲液，加入200微升原抗体溶液。在室温下在黑暗的加湿室中孵育45分钟后，用PBS洗三次水井。
去除PBS并加入200微升的二次抗体混合物。在室温下在黑暗的加湿室中孵育45分钟。然后用 PBS 洗井三次。
在用防淡水安装幻灯片之前，用去氧化水清洗。放置一个盖玻璃，将滑梯存放在四摄氏度的黑暗中。使用共和显微镜，每个样本拍摄三到五张随机场图像，然后进行图像分析。
要计算DNA损伤反应，请下载并安装 CellProfiler。从文件中选择文件、导入、管道，并选择名为 puncti Gamma-H2AX 的管道文件。将包含 Gamma-H2AX foci 采集图像的文件夹拖放到输入模块图像部分的文件列表窗口中进行分析。
然后按照文本协议中所示的说明进行操作。要设置图像的参数，请将所需的图像拖动到文件列表中进行分析。在输入模块下，选择图像。
在输入模块中，选择元数据，然后选择名称和类型。对于组，选择"否"。在分析模块中工作，选择颜色到灰色。
然后选择平滑，选择标识主对象，然后再次选择平滑。接下来选择增强或抑制要素，然后选择标识主对象。仍在分析模块中工作，选择相关对象，然后对对象进行分类，最后选择导出到电子表格。
单击分析左下角面板的图像以执行图像分析。在成功完成分析时，将生成多个图像。请注意生成并保存在计算机上的适当位置的 CSV 文件。
此文件包含定量数据，供进一步分析。在称为"我的实验图像"的电子表格中，列 B 将具有最多具有 5 个 puncti 的核数，而列 D 的核数将具有超过 5 个 puncti 的核数。添加列 B 和 D 以获得核总数。
对所有图像重复这些步骤，在每次分析之前更改我的实验文件名。此处显示了来自多索处理和非处理 iPS 细胞的彗星的代表性显微图。在 iPS 细胞中发现了一定量的 DNA 损伤，表示为 DNA 损伤和尾部时刻的一小部分。
然而，doxo治疗增加了 iPS 细胞的 DNA 损伤，表明彗星测定可用于评估多能干细胞中的 DNA 完整性。此处显示了伽玛-H2AX 免疫标记的代表性显微图，放大率较低，放大率较高。在对照iPS衍生的心肌细胞中，超过90%的细胞每核的DDR foci小于5个。
总共不到10%的细胞每核有6个以上的DDR foci。对于培养六个月的iPS衍生心肌细胞，只有不到90%的细胞每核有5个DDR foci，总共超过13%的细胞每核有6个以上的DDR foci。而在多索治疗的iPS衍生心肌细胞中，只有不到80%的细胞每核有5个DDR foci。
并且总共约24%的细胞每核有6个以上的DDR foci。数据表明，长期的 iPS 衍生心肌细胞培养和多索治疗诱发显著的 DNA 损伤，使其不适合细胞移植。混合细胞悬浮液时避免变量非常重要，因为这可能会影响电泳。
按照这个程序，你可以对各种类型的细胞进行彗星测定和免疫标记程序。这些技术将允许在细胞移植研究之前评估各种细胞的DNA损伤。
