从产后小鼠小脑中纯化Promin-1⁺干细胞

该协议描述了一种简单且具有成本效益的方法，用于从产后小脑中纯化干细胞。这些干细胞占晚期分子混乱的内皮龙，但也是产后衍生的小脑星细胞。因此，研究这些细胞显然对了解小脑的发展很重要。

使用该协议，干细胞的产生与基于 FACS 的策略相当，这种策略通常比其昂贵 10 倍。该协议可以推广，从其他组织，如肠道和骨髓中提取蛋白-1表达干细胞。首先将大脑的盘子放在解剖显微镜下。

使用细数五钳从小脑中去除脑膜和大血管，然后用铲子将小脑从脑干中分离。将小脑转移到含有5毫升冰冷HSS溶液的15毫升离心管中。冲洗它，然后将HBSS去掉。

再重复洗涤两次。最后一次冲洗后，加入五毫升的木瓜组织分离溶液，这些溶液已预热至37摄氏度。在37摄氏度的水浴中孵育组织15分钟，每三分钟倒置3至5次，慢慢混合管内物。

在 Bunsen 燃烧器上进行火抛光，准备宽直径和窄直径玻璃巴斯德移液器。孵育后，用五毫升的HSS溶液洗三次组织，确保避免在脱液时失去组织。上次HBSS洗涤后，将5毫升DPBS与250微升DNAse添加到组织中，用宽直径巴斯德移液器轻轻三叶草10至15次将其分离。

然后使用狭窄的巴斯德移液器进一步三化组织浆料10次。如果较大的组织仍然存在，用移液器尖端将它们压在管的底部，然后继续移液，直到达到精细悬浮液。将离心管放在冰上。

然后通过40微米细胞过滤器将分离的细胞应变成50毫升的管。在过滤器顶部加10毫升冰冷HSS溶液，确保细胞通过网格。将过滤过的细胞转移到一个新的15毫升离心管中，在4摄氏度下以300倍g离心，10分钟。

然后使用真空吸气器完全去除上一液。将细胞颗粒重新悬浮在160微升的冰冷磁柱缓冲液中。在细胞悬浮液中加入40微升抗多明因-1微珠。

然后在冰箱中孵育管子15分钟，使抗体与蛋白-1表达细胞结合。用一到两毫升的柱缓冲液X清洗细胞，并在300次g下离心10分钟。吸升液，将颗粒重新悬浮在一毫升柱缓冲液X.将磁柱放在磁支架上，用500微升缓冲液X冲洗一次。

用500微升缓冲器X洗三次柱，然后从磁场中取出柱子，放在1.5毫升管中。加入一毫升培养培养剂，将柱塞推入柱中，以冲洗标有蛋白-1珠子的细胞。要通过神经球，将它们与培养培养剂一起转移到无菌的15毫升离心管中。

以300次g离心将神经球挖碎5分钟，然后丢弃上经剂。将颗粒与木瓜素或0.05%的三辛辛溶液重新在5毫升分离介质中，并在37摄氏度下孵育细胞10分钟。再次将电池悬架离心。

然后将细胞重新在神经球介质的五毫升中重新暂停，然后用巴斯德移液器缓慢上下移液10次，使细胞分离。如文本协议所述，在神经球培养中培养细胞，并在培养7至10天后，如前面所述，用继发性神经球丰富细胞。在血细胞计上计算细胞数，并在未来实验中对多D-lysine涂层板上的最佳细胞数进行镀。

柱纯化的表蛋白-1阳性产后小脑干细胞形成神经球的生长因子丰富的神经球介质。这些神经球对普明-1呈阳性，它们用于分离和其他干细胞标记，如巢和GFAP。流中细胞染色阴性为干细胞标记蛋白-1和巢和阳性的神经元标记β-III浴缸。

当生长因子的退出和白血病抑制因子或PDGF-AA的存在，普明-1阳性神经球分化成神经元，星形细胞和寡头细胞。在尝试这种技术时，重要的是要确保神经球被推动通过prominin-1抗体，他们可以通过，因为正常细胞也倾向于形成团块，可能看起来像神经球。使用这种隔离方法，可以在健康和疾病条件下描述其衍生血统，如神经元和胶质。

这种方法很有价值，为小脑干细胞在小脑发育和疾病状况（如脊柱癌和癌症）中的作用提供了新的见解。