يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لتنقية الخلايا الجذعية من المخيخ بعد الولادة. هذه الخلايا الجذعية مسؤولة عن المتأخرات من الولادة المُتدرّبة المشوهة جزيئياً، لكنها أيضاً مسؤولة عن الخلايا الفلكية cerebellar المشتقة بعد الولادة. وهكذا، دراسة هذه الخلايا مهم بوضوح لفهم تطور المخيخ.
وباستخدام هذا البروتوكول، فإن عائد الخلايا الجذعية يماثل عائد الاستراتيجية القائمة على FACS والتي عادة ما تكون أكثر تكلفة بعشر مرات. يمكن تعميم هذا البروتوكول لاستخراج الخلايا الجذعية المعبرة عن البرامين-1 من الأنسجة الأخرى مثل الأمعاء ونخاع العظام. تبدأ بوضع الطبق مع الدماغ تحت مجهر تشريح.
استخدام غرامة عدد خمسة ملقط لإزالة السحايا والأوعية الدموية الكبيرة من المخيخ، ثم فصل المخيخ من جذع الدماغ باستخدام ملعقة. نقل المخيخ إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من الجليد الباردة HBSS حل. شطف ثم decant HBSS.
كرر الغسيل مرتين اُكرَان. بعد الشطف الأخير ، أضف خمسة ملليلترات من محلول تفكك الأنسجة القائم على البابين الذي تم تسخينه مسبقًا إلى 37 درجة مئوية. احتضان الأنسجة لمدة 15 دقيقة في حمام الماء 37 درجة مئوية وخلط محتويات الأنبوب ببطء عن طريق عكس ثلاث إلى خمس مرات كل ثلاث دقائق.
إعداد قطر واسع وضيق القطر الزجاج باستور ماصة عن طريق تلميع النار على الموقد بونسن. بعد الحضانة، وغسل الأنسجة ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من حل HBSS التأكد من تجنب فقدان الأنسجة أثناء decanting. بعد غسل HBSS الماضي، إضافة خمسة ملليلتر من DPBS مع 250 ميكرولتر من DNAse إلى الأنسجة وفصله عن طريق triturating بلطف 10 إلى 15 مرات مع ماصة باستر قطرها الواسع.
ثم استخدام ماصة باستور الضيقة لزيادة triturate الطين الأنسجة 10 مرات. إذا بقيت قطع أكبر من الأنسجة، اضغط عليها ضد الجزء السفلي من الأنبوب مع طرف الماصات وتستمر pipetting حتى يتم تحقيق تعليق غرامة. ضع أنابيب الطرد المركزي على الجليد.
ثم سلالة الخلايا المتفككة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. قم بالتصفية مع 10 ملليلترات من محلول HBSS البارد الجليدي لضمان مرور الخلايا عبر الشبكة. نقل الخلايا المصفاة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي 15 ملليلتر والطرد المركزي في تعليق 300 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
ثم استخدام الطامح فراغ لإزالة عظمى تماما. Resuspend بيليه الخلية في 160 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة العمود المغناطيسي. أضف 40 ميكرولترات من الميكروبات المضادة للبرومينين-1 إلى تعليق الخلية.
ثم احتضان الأنابيب في الثلاجة لمدة 15 دقيقة للسماح للجسم المضاد لربط الخلايا المعبرة عن البرمينيين-1. اغسل الخلايا بميليلتر إلى مليلتر من عمود العازلة X والطرد المركزي لهم في 300 مرة ز لمدة 10 دقائق. اشعاعات عظمى و resuspend بيليه في ملليلتر واحد من العمود العازلة X.Place الأعمدة المغناطيسية على الحامل المغناطيسي وشطف لهم مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من العازلة X.Apply تعليق الخلية المسمى على العمود وجمع تدفق من خلال في أنابيب 15 ملليلتر الطازجة.
غسل العمود ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من X.ثم العازلة إزالة الأعمدة من المجال المغناطيسي ووضعها في أنابيب 1.5 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من الثقافة المتوسطة ودفع المكبس في العمود لطرد الخلايا الموسومة مع الخرز prominin-1. لتمرير الـ neurospheres، نقلها جنبا إلى جنب مع المتوسطة الثقافة في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر معقمة.
بيليه في الاعصاب عن طريق الطرد المركزي في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من عظمى. Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام تفكك مع باباين أو 0.05٪ تريبسين الحل واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى.
ثم إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من وسط الغلاف العصبي وفصلها عن طريق الأنابيب ببطء لهم صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة باستور. لوحة الخلايا في وسائط الغلاف العصبي كما هو موضح في بروتوكول النص وإثراء لهم مع neurospheres الثانوية بعد سبعة إلى 10 أيام في الثقافة كما وصف سابقا. عد الخلايا على مقياس الهيموسيت وطبقة العدد الأمثل من الخلايا على لوحات المغلفة بولي-D-lysine للتجارب المستقبلية.
العمود تنقية برومينين-1 إيجابية بعد الولادة cerebellar الخلايا الجذعية شكلت الخلايا العصبية في عامل النمو الغنية neurosphere المتوسطة. وكانت هذه الخلايا العصبية إيجابية بالنسبة للبرومينين-1، وهي علامة تستخدم لعزلها ولعلامات الخلايا الجذعية الأخرى مثل النسستين وGFAP. الخلايا في التدفق من خلال السلبية الملطخة لعلامات الخلايا الجذعية برومينين-1 و نستين وإيجابية لعلامة الخلايا العصبية بيتا الثالث tubulin.
عند سحب عوامل النمو وفي وجود عامل مثبط لسرطان الدم أو PDGF-AA، فإن الخلايا العصبية الإيجابية prominin-1 تختلف إلى الخلايا العصبية، الخلايا الفلكية و oligodendrocytes. عند محاولة هذه التقنية، من المهم للتأكد من أن يتم دفع الخلايا العصبية من خلال للأجسام المضادة البروميين-1 ويمكن أن تمر لأن الخلايا الطبيعية تميل أيضا إلى تشكيل كتل التي قد تبدو وكأنها الخلايا العصبية. باستخدام هذه الطريقة العزل، يمكن للمرء أن يميز أنساب مشتقة مثل الخلايا العصبية وglia في حالة الصحة والمرض.
هذه الطريقة قيمة وتوفر نظرة جديدة على دور الخلايا الجذعية cerebellar في التنمية cerebellar وظروف المرض مثل الرنح spinocerebellar والسرطان.
