Этот протокол описывает простой и экономически эффективный метод очистки стволовых клеток от послеродового мозжечка. Эти стволовые клетки составляют позднерожденные молекулярно искаженные интернейроны, но они также составляют постнатально полученные мозжечковые астроциты. Таким образом, изучение этих клеток, безусловно, важно для понимания развития мозжечка.
Используя этот протокол, выход стволовых клеток сопоставим с стратегией, основанной на FACS, которая, как правило, в 10 раз дороже. Этот протокол может быть обобщен для извлечения проминина-1 экспрессии стволовых клеток из других тканей, таких как кишечник и костный мозг. Начните с размещения блюдо с мозгом под микроскопом вскрытия.
Используйте тонкое число пять тибры для удаления опоясывания и крупных кровеносных сосудов из мозжечка, а затем отделить мозжечок от ствола мозга с помощью шпателя. Перенесите мозжечок в 15-миллилитровую центрифугу, содержащую пять миллилитров ледяного раствора HBSS. Промыть его затем decant HBSS.
Повторите стирку еще два раза. После последнего полоскания добавьте пять миллилитров раствора диссоциации тканей на основе папаина, который предварительно разогрет до 37 градусов по Цельсию. Инкубировать ткани в течение 15 минут в 37 градусов по Цельсию водяной бане и медленно смешивать содержимое трубки, инвертирование его три-пять раз каждые три минуты.
Подготовка широкого диаметра и узкого диаметра стекла Пастер пипетки путем пожара полировки над горелки Bunsen. После инкубации, мыть ткани три раза с пятью миллилитров раствора HBSS убедившись, чтобы избежать потери ткани во время декантации. После последнего мытья HBSS, добавить пять миллилитров DPBS с 250 микролитров DNAse в ткани и разобщить его, мягко тритурируя 10 до 15 раз с широким диаметром Пастер пипетки.
Затем используйте узкую трубу Пастера для дальнейшего тритурата навоза ткани 10 раз. Если остаются более крупные кусочки ткани, прижимайте их к нижней части трубки кончиком пипетки и продолжайте трубоубезго до тех пор, пока не будет достигнута тонкая подвеска. Поместите центрифуги труб на льду.
Затем процедите диссоциированные клетки через 40-метровый клеточный ситечко в 50 миллилитровую трубку. Топ фильтр с 10 миллилитров ледяного решения HBSS для обеспечения того, чтобы клетки проходят через сетку. Перенесите фильтрованные клетки в свежую 15-миллилитровую центрифугу и центрифуга подвески при 300 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Затем используйте вакуумный аспиратор, чтобы удалить супернатант полностью. Перепродюсните гранулы клетки в 160 микролитров буфера ледяной холодной магнитной колонки. Добавьте 40 микролитров антипроминин-1 микробусов к клеточной подвеске.
Затем инкубировать трубки в холодильнике в течение 15 минут, чтобы антитела связываться с проминин-1 экспрессии клеток. Вымойте клетки с одного до двух миллилитров буфера столбца X и центрифуги их в 300 раз г в течение 10 минут. Аспирировать супернатант и повторно использовать гранулы в один миллилитр колонки буфера X.Place магнитных столбцов на магнитной подготе и промыть их один раз с 500 микролитров буфера X.Apply помечены подвески клеток на колонку и собирать поток в свежих 15 миллилитров труб.
Вымойте столбец три раза с помощью 500 микролитров буфера X.Then удалите колонны из магнитного поля и поместите их в 1,5 миллилитровые трубки. Добавьте один миллилитр среды культуры и нажмите поршень в колонку, чтобы избавиться от клеток, помеченных бусами prominin-1. Чтобы пройти нейросферы, передать их вместе с культурой среды в стерильные 15 миллилитров центрифуги трубки.
Пеллет нейросферы центрифугации в 300 раз g в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Повторное увеличение гранул в пяти миллилитров диссоциации средств массовой информации с папаином или 0,05%трипсина раствора и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Снова центрифугировать подвесную клетку.
Затем повторного перерасхода клеток в пять миллилитров нейросферы среды и разобщить их медленно трубопроводов их вверх и вниз в 10 раз с Пастер пипетки. Плита клетки в нейросфере средств массовой информации, как описано в текстовом протоколе и обогатить их вторичных нейросфер после семи до 10 дней в культуре, как описано ранее. Подсчитайте клетки на гемоцитометре и пластины оптимальное количество клеток на поли-D-лизин покрытием пластин для будущих экспериментов.
Колонка очищенных проминин-1 положительные послеродовые мозжечковые стволовые клетки образуют нейросферы в фактор роста богатых нейросферы среды. Эти нейросферы были положительными для проминина-1, их маркер, используемый для изоляции и для других маркеров стволовых клеток, таких как nestin и GFAP. Клетки в flowthrough окрашенных отрицательных для маркеров стволовых клеток проминин-1 и nestin и положительный для нейронального маркера бета-III тубулин.
При снятии факторов роста и при наличии ингибиторного фактора лейкемии или PDGF-AA, проминин-1 положительные нейросферы дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты. При попытке этого метода, важно, чтобы убедиться, что нейросферы проталкиваются для проминина-1 антитела, и они могут быть прошли, потому что нормальные клетки также, как правило, образуют сгустки, которые могут выглядеть как нейросферы. Используя этот метод изоляции, можно охарактеризовать его производные линии, такие как нейроны и глиа в состоянии здоровья и болезней.
Этот метод является ценным и дает новое представление о роли мозжечковых стволовых клеток в мозжечковом развитии и заболеваниях, таких как спиноцеребелларная атаксия и рак.
