Ce protocole décrit une méthode facile et rentable pour purifier les cellules souches du cervelet postnatal. Ces cellules souches expliquent les interneurones moléculairement garbled de la fin de naissance, mais elles expliquent également les astrocytes cerebellar postnatally-dérivés. Ainsi, l’étude de ces cellules est clairement importante pour comprendre le développement du cervelet.
En utilisant ce protocole, le rendement des cellules souches est comparable à celui de la stratégie basée sur le FACS qui est généralement 10 fois plus cher. Ce protocole peut être généralisée pour extraire la prominine-1 exprimant les cellules souches d’autres tissus tels que l’intestin et la moelle osseuse. Commencez par placer le plat avec le cerveau sous un microscope de dissection.
Utilisez les fines forceps numéro cinq pour enlever les méninges et les gros vaisseaux sanguins du cervelet, puis séparez le cervelet du tronc cérébral à l’aide de la spatule. Transférer le cervelet dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres contenant cinq millilitres de solution HBSS glacée. Rincez-le puis décantez le HBSS.
Répétez le lavage deux fois de plus. Après le dernier rinçage, ajouter cinq millilitres de solution de dissociation des tissus à base de papain qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Incuber le tissu pendant 15 minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius et mélanger lentement le contenu du tube en l’inversant trois à cinq fois toutes les trois minutes.
Préparer une pipette Pasteur en verre de grand diamètre et de diamètre étroit en polissant le feu sur un brûleur Bunsen. Après l’incubation, lavez le tissu trois fois avec cinq millilitres de solution HBSS en vous assurant d’éviter de perdre des tissus pendant la décantation. Après le dernier lavage HBSS, ajouter cinq millilitres de DPBS avec 250 microlitres de DNAse au tissu et le dissocier en triturant doucement 10 à 15 fois avec la pipette Pasteur de grand diamètre.
Ensuite, utilisez l’étroite pipette Pasteur pour triturer davantage la boue tissulaire 10 fois. S’il reste de plus gros morceaux de tissu, appuyez-les contre le fond du tube avec la pointe de la pipette et continuez à pipetage jusqu’à ce qu’une suspension fine soit atteinte. Déposer les tubes de centrifugeuse sur la glace.
Puis filtrer les cellules dissociées à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Garnir le filtre de 10 millilitres de solution HBSS glacée pour s’assurer que les cellules passent à travers le maillage. Transférer les cellules filtrées dans un tube de centrifugeuse frais de 15 millilitres et centrifuger la suspension à 300 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, utilisez un aspirateur pour enlever complètement le supernatant. Resuspendez la pastille cellulaire dans 160 microlitres de tampon de colonne magnétique glacée. Ajouter 40 microlitres de microbilles anti-prominine-1 à la suspension cellulaire.
Ensuite, incuber les tubes dans un réfrigérateur pendant 15 minutes pour permettre à l’anticorps de se lier aux cellules exprimant la prominine-1. Lavez les cellules avec un à deux millilitres de tampon de colonne X et centrifugez-les à 300 fois g pendant 10 minutes. Aspirez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de tampon de colonne X.Placez les colonnes magnétiques sur le support magnétique et rincez-les une fois avec 500 microlitres de tampon X.Appliquez la suspension cellulaire étiquetée sur la colonne et recueillez le flowthrough dans des tubes frais de 15 millilitres.
Lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon X.Then retirez les colonnes du champ magnétique et placez-les dans des tubes de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de milieu de culture et pousser le piston dans la colonne pour rincer les cellules étiquetées avec des perles prominin-1. Pour passer les neurosphères, transférez-les avec le milieu de culture dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 millilitres.
Pelleter les neurosphères par centrifugation à 300 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Resuspendez la pastille en cinq millilitres de médias de dissociation avec la papaine ou la solution d’trypsine de 0,05% et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifugez à nouveau la suspension cellulaire.
Puis résuspendez les cellules en cinq millilitres de milieu de neurosphère et dissociez-les en les pipetant lentement de haut en bas 10 fois avec une pipette Pasteur. Plaquez les cellules dans les médias de la neurosphère tel que décrit dans le protocole du texte et enrichissez-les de neurosphères secondaires après sept à dix jours de culture comme décrit précédemment. Comptez les cellules sur un hémocytomètre et plaquez le nombre optimal de cellules sur des plaques recouvertes de poly-D-lysine pour de futures expériences.
Les cellules souches cerebellar postnatales positives de prominin-1 purifiées de colonne ont formé des neurosphères dans le milieu riche de neurosphère de facteur de croissance. Ces neurosphères étaient positives pour la prominine-1, leur marqueur utilisé pour l’isolement et pour d’autres marqueurs de cellules souches tels que la nichine et le GFAP. Cellules dans le flowthrough taché négatif pour les marqueurs de cellules souches prominin-1 et nestin et positif pour le marqueur neuronal bêta-III tubuline.
Lors du retrait des facteurs de croissance et en présence du facteur inhibiteur de leucémie ou PDGF-AA, les neurosphères positives prominin-1 se sont différenciées en neurones, astrocytes et oligodendrocytes. Lorsque vous essayez cette technique, il est important de s’assurer que les neurosphères sont poussées à travers pour la prominine-1 anticorps et ils peuvent être adoptés parce que les cellules normales ont également tendance à former des touffes qui peuvent ressembler à des neurosphères. En utilisant cette méthode d’isolement, on peut caractériser ses lignées dérivées comme les neurones et les gliales dans l’état de santé et de maladie.
Cette méthode est précieuse et fournit un nouvel aperçu du rôle des cellules souches cerebellar dans le développement cerebellar et les conditions de la maladie comme l’ataxie spinocerebellar et le cancer.
