פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה וחסכונית לטיהור תאי גזע מהקטנום שלאחר הלידה. תאי גזע אלה אחראים לאינטרואורונים שנולדו מאוחר מדי מבחינה מולקולרית, אך הם גם מהווים אסטרוציטים מוחיים שמקורם לאחר הלידה. לכן, לימוד תאים אלה חשוב בבירור להבנת התפתחות המוח הקטן.
באמצעות פרוטוקול זה, התשואה של תאי גזע דומה לזו של אסטרטגיה מבוססת FACS שהיא בדרך כלל יקרה פי 10. פרוטוקול זה יכול להיות מוכלל כדי לחלץ prominin-1 המביעים תאי גזע מרקמות אחרות כגון המעי ומח העצם. התחל על ידי הנחת המנה עם המוח תחת מיקרוסקופ ניתוח.
השתמש מדפים מספר חמש בסדר כדי להסיר את קרום המוח וכלי דם גדולים מן המוח הקטן, ולאחר מכן להפריד את המוח הקטן מן המוח באמצעות מרית. העבר את המוח הקטן לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פתרון HBSS קר כקרח. לשטוף אותו ואז decant HBSS.
חזור על לשטוף פעמיים נוספות. לאחר שטיפה האחרונה, להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון דיסוציאציה רקמות מבוסס פפאין כי כבר התחמם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. דגירה הרקמה במשך 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לאט לערבב את התוכן של הצינור על ידי היפוך זה שלוש עד חמש פעמים כל שלוש דקות.
הכן קוטר רחב וקוטר צר זכוכית פיפיטור פסטר על ידי ליטוש אש מעל מבער בונזן. לאחר הדגירה, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של פתרון HBSS הקפדה להימנע לאבד רקמה תוך decanting. לאחר לשטוף HBSS האחרון, להוסיף חמישה מיליליטר של DPBS עם 250 microliters של DNAse לרקמה ולנתק אותו על ידי triturating בעדינות 10 עד 15 פעמים עם פיפט פסטר קוטר רחב.
לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר צר כדי עוד יותר triturate תרחיף הרקמה 10 פעמים. אם חתיכות גדולות יותר של רקמה להישאר, לחץ אותם על החלק התחתון של הצינור עם קצה פיפטה ולהמשיך צינורות עד השעיה בסדר מושגת. מניחים את צינורות הצנטריפוגה על קרח.
ואז מסננים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר. העליון את המסנן עם 10 מיליליטר של פתרון HBSS קר כקרח כדי להבטיח כי התאים לעבור דרך רשת. מעבירים את התאים המסוננים לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מיליליטר ומעבירים את ההשעיה פי 300 למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן השתמשו בשואפטור ואקום כדי להסיר את העל-טבעי לחלוטין. תן שימוש חוזר לכדור התא ב-160 מיקרוליטרים של חיץ עמודים מגנטיים קר כקרח. הוסף 40 מיקרוליטרים של מיקרוביאדות אנטי-פרומינין-1 לתליית התא.
לאחר מכן לה הדגירה את הצינורות במקרר במשך 15 דקות כדי לאפשר לנוגדן להיקשר לתאי ההבעה prominin-1. לשטוף את התאים עם אחד עד שני מיליליטר של חיץ עמוד X צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים g במשך 10 דקות. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מאגר העמודות X.Place העמודים המגנטיים על הכן המגנטי ושטוף אותם פעם אחת עם 500 מיקרוליטרים של חיץ X.Apply המתלה התא המסומן על העמודה ולאסוף את flowthrough בצינורות טריים 15 מיליליטר.
לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ X.Then להסיר את העמודים מהשדה המגנטי ולמקום אותם 1.5 צינורות מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבות ולדחוף את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים מתויגים עם חרוזים prominin-1. כדי לעבור את הנוירוספרות, להעביר אותם יחד עם מדיום התרבות לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מיליליטר.
גלולה את הנוירוספרות על ידי צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. Resuspend גלולה בחמישה מיליליטר של מדיה דיסוציאציה עם פפאין או 0.05% פתרון טריפסין דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה ההשעיה התא שוב.
ואז תן שימוש חוזר בתאים בחמישה מיליליטר של מדיום נוירוספרה ותנתק אותם על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה פסטר. צלחת התאים במדיה נוירוספרית כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולהעשיר אותם עם נוירוספרות משניות לאחר שבעה עד 10 ימים בתרבות כפי שתואר קודם לכן. לספור את התאים על המוציטמטר צלחת המספר האופטימלי של תאים על לוחות מצופים פולי D-ליסין לניסויים עתידיים.
עמודה מטוהרת prominin-1 חיובי לאחר הלידה תאי גזע מוחיים יצרו נוירוספרות במדיום נוירוספרה עשיר גורם גדילה. נוירוספרות אלה היו חיוביות עבור prominin-1, הסמן שלהם המשמש לבידוד עבור סמני תאי גזע אחרים כגון nestin ו GFAP. תאים בזרימה מוכתמים שלילי עבור סמני תאי גזע prominin-1 ו nestin וחיובי עבור סמן עצבי בטא-III tubulin.
עם נסיגת גורמי גדילה ובנוכחות גורם מעכב לוקמיה או PDGF-AA, הנוירוספרות החיוביות פרומינין-1 הבדילו לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים. כאשר מנסים טכניקה זו, חשוב לוודא את הנוירוספרות נדחפים דרך נוגדן prominin-1 והם יכולים להיות מעבר כי תאים נורמליים גם נוטים ליצור גושים אשר עשוי להיראות כמו נוירוספרות. בשיטת בידוד זו, ניתן לאפיין את השושלת הנגזרת שלה כמו נוירונים וגליה במצב בריאותי ומחלות.
שיטה זו היא בעלת ערך ומספקת תובנה חדשנית על תפקידם של תאי גזע מוחיים בהתפתחות מוחית ותנאי מחלה כמו ספינוקרבלאר אטקסיה וסרטן.
