Este protocolo descreve um método fácil e econômico para purificar células-tronco do cerebelo pós-natal. Essas células-tronco são responsáveis pelos interneurônios moleculares, mas também são responsáveis por astrócitos cerebelares derivados pós-naturais. Assim, estudar essas células é claramente importante para entender o desenvolvimento do cerebelo.
Usando este protocolo, o rendimento da célula-tronco é comparável ao da estratégia baseada em FACS, que normalmente é 10 vezes mais cara. Este protocolo pode ser generalizado para extrair prominina-1 expressando células-tronco de outros tecidos, como intestino e medula óssea. Comece colocando o prato com o cérebro sob um microscópio de dissecção.
Use fórceps de número cinco para remover os meninges e grandes vasos sanguíneos do cerebelo, em seguida, separe o cerebelo do tronco cerebral usando a espátula. Transfira o cerebelo para um tubo centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros de solução HBSS gelada. Enxágüe-o e depois decante o HBSS.
Repita a lavagem mais duas vezes. Após a última lavagem, adicione cinco mililitros de solução de dissociação de tecido à base de papain que foi pré-aquecida a 37 graus Celsius. Incubar o tecido por 15 minutos em um banho de água de 37 graus Celsius e misturar lentamente o conteúdo do tubo invertendo-o três a cinco vezes a cada três minutos.
Prepare uma pipeta pasteur de diâmetro largo e de diâmetro estreito polindo sobre um queimador Bunsen. Após a incubação, lave o tecido três vezes com cinco mililitros de solução HBSS, certificando-se de evitar perder tecido durante a decantação. Após a última lavagem hbss, adicione cinco mililitros de DPBS com 250 microliters de DNAse ao tecido e dissocia-o, triturando suavemente de 10 a 15 vezes com a pipeta Pasteur de diâmetro largo.
Em seguida, use a pipeta pasteur estreita para triturar ainda mais o chorume tecidual 10 vezes. Se permanecerem pedaços maiores de tecido, pressione-os contra a parte inferior do tubo com a ponta da pipeta e continue a pipetar até que uma suspensão fina seja alcançada. Coloque os tubos de centrífuga no gelo.
Em seguida, coe as células dissociadas através de um coador de células de 40 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Cubra o filtro com 10 mililitros de solução HBSS gelada para garantir que as células passem pela malha. Transfira as células filtradas para um tubo fresco de centrífuga de 15 mililitros e centrifugar a suspensão a 300 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, use um aspirador de vácuo para remover completamente o supernatante. Resuspend a pelota celular em 160 microliters de tampão de coluna magnética gelada. Adicione 40 microliters de microesferas anti-prominina-1 à suspensão celular.
Em seguida, incubar os tubos em uma geladeira por 15 minutos para permitir que o anticorpo se ligue às células expressas de prominina-1. Lave as células com um a dois mililitros de tampão de coluna X e centrifuá-las a 300 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernatante e resuspenja a pelota em um mililitro de tampão de coluna X.Coloque as colunas magnéticas no suporte magnético e enxágue-as uma vez com 500 microliters de buffer X.Aplique a suspensão celular rotulada na coluna e colete o fluxo através de tubos frescos de 15 mililitros.
Lave a coluna três vezes com 500 microliters de buffer X.Em seguida, remova as colunas do campo magnético e coloque-as em tubos de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de meio de cultura e empurre o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células marcadas com contas de prominina-1. Para atravessar as neurosferas, transfira-as junto com o meio de cultura para um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéril.
Pellule as neuroesferas por centrifugação a 300 vezes g por cinco minutos e descarte o supernatante. Resuspenme a pelota em cinco mililitros de mídia de dissociação com solução de papain ou 0,05% trypsin e incubar as células a 37 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugar a suspensão celular novamente.
Em seguida, resuspende as células em cinco mililitros de neurosfera média e dissociá-las lentamente pipetando-as para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta Pasteur. Assode as células na mídia da neurosfera, como descrito no protocolo de texto e enriqueça-as com neuroesferas secundárias após sete a dez dias de cultura, como descrito anteriormente. Conte as células em um hemócito e plaque o número ideal de células em placas revestidas de poli-D-lysina para experimentos futuros.
A coluna purificada prominina-1 células-tronco cerebelares pós-natal positivas formaram neuroesferas em meio neurosfera rico em fator de crescimento. Essas neuroesferas foram positivas para prominina-1, seu marcador usado para isolamento e para outros marcadores de células-tronco, como nestin e GFAP. Células no fluxo através de marcadores de células-tronco prominin-1 e nestin e positivo para tubulina marcador neuronal beta-III.
Após a retirada de fatores de crescimento e na presença de fator inibidor da leucemia ou PDGF-AA, as neuroesferas positivas de prominina-1 se diferenciaram em neurônios, astrócitos e oligodenrócitos. Ao tentar essa técnica, é importante garantir que as neurosferas sejam empurradas para anticorpos prominina-1 e possam ser passagens porque as células normais também tendem a formar aglomerados que podem parecer neurosferas. Usando esse método de isolamento, pode-se caracterizar suas linhagens derivadas como neurônios e glia em saúde e condição de doença.
Este método é valioso e fornece uma nova visão sobre o papel das células-tronco cerebelares no desenvolvimento cerebelar e em condições de doenças como ataxia spinocerebellar e câncer.
