Bu protokol, postnatal serebellumkök hücreleri arındırmak için kolay ve uygun maliyetli bir yöntem açıklar. Bu kök hücreler geç doğan moleküler olarak bozuk internöronları oluştururlar, ama aynı zamanda postnatal kaynaklı serebellar astrositleri de oluştururlar. Bu nedenle, bu hücrelerin incelenmesi açıkça beyincik gelişimini anlamak için önemlidir.
Bu protokolü kullanarak, kök hücre verimi genellikle 10 kat daha pahalı FACS tabanlı strateji ile karşılaştırılabilir. Bu protokol bağırsak ve kemik iliği gibi diğer dokulardan prominin-1 ifade kök hücreleri ayıklamak için genelleştirilmiş olabilir. Bir diseksiyon mikroskobu altında beyin ile çanak yerleştirerek başlayın.
Serebellum menenjler ve büyük kan damarları kaldırmak için ince sayı beş forceps kullanın, sonra spatula kullanarak beyin sapından beyincik ayırmak. Serebellum buz gibi HBSS çözeltisi beş mililitre içeren 15 mililitrelik santrifüj tüp içine aktarın. Durulayın sonra HBSS decant.
Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Son durulama dan sonra, 37 santigrat derece önceden ısıtılmış olan papain bazlı doku dissosifikasyon çözeltisi beş mililitre ekleyin. 37 derece santigrat su banyosunda 15 dakika boyunca doku kuluçka ve yavaş yavaş her üç dakikada üç kez ters çevirerek tüp içeriğini karıştırın.
Bir Bunsen brülör üzerinde yangın parlatma tarafından geniş çaplı ve dar çaplı cam Pasteur pipet hazırlayın. Kuluçkadan sonra, dekanting sırasında doku kaybetmemek için emin olmak için HBSS çözeltisi beş mililitre ile doku üç kez yıkayın. Son HBSS yıkamadan sonra, dokuya 250 mikrolitre NAAse ile beş mililitre DPBS ekleyin ve geniş çaplı Pasteur pipetiyle 10 ila 15 kez hafifçe üçe tekse ile ayırın.
Daha sonra doku bulamacını 10 kez daha fazla triturate için dar Pasteur pipet kullanın. Daha büyük doku parçaları kalırsa, pipet ucuyla tüpün dibine bastırın ve ince bir süspansiyon elde edilene kadar pipetleme devam edin. Santrifüj tüplerini buzüzerine yerleştirin.
Sonra 50 mililitrelik bir tüp içine 40 mikrometre hücresüz ile ayrıştırılmış hücreleri süzün. Hücrelerin örgüden geçmesini sağlamak için 10 mililitre buz gibi HBSS çözeltisi ile filtreyi toplayın. Filtrelenmiş hücreleri taze 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve süspansiyonu 300 kez g'de 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Sonra tamamen supernatant kaldırmak için bir vakum aspiratör kullanın. 160 mikrolitre buz gibi manyetik kolon tamponunda hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 40 mikrolitre anti-prominin-1 mikroboncuk ekleyin.
Daha sonra tüpleri 15 dakika buzdolabında kuluçkaya yatırArak antikorun prominin-1 ifade eden hücrelere bağlanmasını bekleyin. Hücreleri 1-2 mililitre lik kolon arabelleği X ile yıkayın ve 300 kez g'de 10 dakika santrifüj edin. Supernatant aspirate ve sütun tampon X.Place manyetik sütunlar bir mililitre içinde pelet resuspend manyetik standı üzerinde manyetik sütunlar yerleştirin ve tampon X.100 mikrolitre ile bir kez durulayın sütun üzerine etiketli hücre süspansiyon uygulayın ve taze 15 mililitre tüpler üzerinden akış toplamak.
Sütunu 500 mikrolitre tampon X ile üç kez yıkayın.Sonra sütunları manyetik alandan çıkarın ve 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. Bir mililitre kültür ortamı ekleyin ve prominin-1 boncuklarla etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütuna itin. Nörosferleri geçiş için, steril bir 15 mililitre santrifüj tüp içine kültür ortamı ile birlikte aktarın.
5 dakika boyunca 300 kez g santrifüj ile nörosferler Pelet ve supernatant atın. Papain veya %0.05 tripsin çözeltisi ile beş mililitre ayrışma mediasında peleti yeniden askıya alın ve hücreleri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna tekrar santrifüj edin.
Sonra nörosfer orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya ve yavaş yavaş bir Pasteur pipet ile 10 kez yukarı ve aşağı boru ile onları ayrıştırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi nörosfer medyahücreleri plaka ve daha önce açıklandığı gibi kültür yedi ila 10 gün sonra ikincil nörosferler ile zenginleştirmek. Hücreleri hemositometrede sayın ve gelecekteki deneyler için poli-D-lizin kaplı plakalar üzerindeki en uygun sayıda hücreyi plakalayın.
Kolon saflaştırılmış prominin-1 pozitif postnatal serebellar kök hücreler büyüme faktörü zengin nörosfer orta nörosferler oluşturdu. Bu nörosferler prominin-1, izolasyon için kullanılan belirteçleri ve nestin ve GFAP gibi diğer kök hücre belirteçleri için pozitifti. Kök hücre belirteçleri prominin-1 ve nestin ve nöronal marker beta-III tubulin için pozitif için lekeli negatif yoluyla akış hücreleri.
Büyüme faktörlerinin geri çekilmesi üzerine ve lösemi inhibitör faktörü veya PDGF-AA varlığında, prominin-1 pozitif nörosferler nöronlar, astrositler ve oligodendrositler farklılaşmış. Bu tekniği denerken, nörosferlerin prominin-1 antikor için itildiğinden emin olmak önemlidir ve normal hücreler de nörosferler gibi görünebilir kümeler oluşturmak eğilimindedir, çünkü onlar geçit edilebilir. Bu izolasyon yöntemini kullanarak, bir sağlık ve hastalık durumunda nöronlar ve glia gibi türev soy karakterize edebilirsiniz.
Bu yöntem değerlidir ve serebellar gelişim ve spinocerebellar ataksi ve kanser gibi hastalık koşullarında serebellar kök hücrelerin rolü ne yeni bir fikir sağlar.
