该协议描述了一种方法，专注于从产后小鼠中同时提取两个最丰富的胶质细胞群，星细胞和微胶质。我们的方法不同于之前描述的星细胞和微胶质分离协议，因为我们专注于在同一条件下获得和隔离同一提取中的两种细胞类型，从而优化了实验动物的使用，并改进了这些细胞在免疫学背景下的相对作用的研究。该协议可用于更好地研究微胶质和星细胞作用，在许多情况下和疾病在中枢神经系统，如阿尔茨海默氏症，帕金森，和感染，例如原生动物寄生虫或病毒。
从同一萃取中获取和隔离两种细胞类型是评估每个细胞子集免疫学背景（如感染或炎症）的比较作用的可取的。人们应该小心，特别是在脑切除和神经组织洗涤，但我相信，有了这个协议和视频拍摄，人们不会挣扎。该协议可以很长，这取决于提取皮质的动物的数量，所以准备花费约四个小时或更多时间。
在第一天，准备纯HBSS和HBSS加上10%的热灭活FBS。准备补充的DMEM F12，并过滤0.22微米过滤器。在消毒器中消毒所有手术器械，并在手术过程中使用 70% 乙醇。
将新生小鼠放入密封室，内含用异氟兰浸湿的棉花，进行五分钟的深刻麻醉。用70%乙醇喷洒老鼠幼崽，用剪刀斩首动物。沿着颅骨用剪刀剪一个下垂的切口，打开它，露出大脑。
用微铲去除大脑，以保持大脑的完整性。将大脑放在一个直径六厘米的干培养皿中。使用微铲，去除嗅觉球和小脑。
将皮层移动到另一个含有两毫升HS加10%FBS的培养皿。用无菌剪刀将脑组织切成小块，并使用 P1000 微管，将每个脑组织与 HBSS 加 10%FBS 转移到不同的 15 毫升锥形管中。如有必要，使用 HBSS 加 10%FBS 将最终体积填充到两毫升。
用三毫升的HBSS加10%FBS清洗切开的脑组织。除臭后，小心取出上经剂。使用 HBSS 加 10%FBS 重复洗涤三次。
然后用三毫升纯HSS洗涤三次。除臭后，小心取出上经剂。接下来，加入三毫升的三辛，将管子放在37摄氏度的水浴中，每5分钟轻轻摇动30分钟。
这将消化收集的组织。避免气泡。要灭活尝试素，用三毫升的HPSS加10%FBS清洗组织，并在组织脱液后，小心地去除上经剂。
重复此洗涤三次。然后用三毫升纯HSS洗涤组织，再重复两次。组织脱液后，小心去除上经剂。
加入7毫升纯HSS，通过移液器的连续通道使组织均质化，首先使用10毫升血清学移液器，然后是5毫升移液器，最后使用P1000微移液器。均质化后，在450倍g下离心管，在4摄氏度下5分钟。丢弃上一杯，用四毫升的 HBSS 加每个管的 10%FBS 重新暂停颗粒。
将细胞转移到商业预处理的T75烧瓶中，以实现最佳的细胞培养粘附。将烧瓶放在37摄氏度的培养箱中，在5%的二氧化碳下放置30分钟， 以进行粘附。然后在烧瓶中加入10毫升补充DMEM F12，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育两晚。
第三天，从T75烧瓶中去除7毫升培养基，加入7毫升新鲜补充的DMEM F12。将烧瓶退回孵化器。第五天，为了去除碎屑和非粘合细胞，用14毫升新鲜补充的DMEM F12从T75烧瓶中交换所有介质。
然后每48小时，去除6毫升的上能，并添加7毫升新鲜补充DMEM F12介质，直到培养的第14天。第14天，在去除6毫升上经剂并加入7毫升新鲜补充的DMEM F12介质后，用塑料包装将T75烧瓶紧紧合上。在200 RPM和37摄氏度的地面轨道摇床中放置它们，以机械地将微胶质与星共体分离。
在第15天，从摇床拿烧瓶，用自己的介质大力清洗，以优化细胞分离，收获最大数量的微胶质。然后收集上流水液，并转移到50毫升锥形管。接下来，在每个烧瓶中加入四毫升的三辛，在37摄氏度下孵育5分钟，以分离星细胞。
然后添加五毫升补充的DMEM F12，以灭活的尝试。用自己的介质清洗烧瓶，然后将烧瓶转移到50毫升锥形管中。在450倍g下将含有分离微胶质或星核细胞的所有管离心，在4摄氏度下5分钟。
丢弃上一杯。将微胶质颗粒在一毫升的补充DMEM F12和星细胞在10毫升的补充DMEM F12。在 Neubauer 室或自动单元格计数器中继续进行细胞计数。
在预处理的平底细胞培养板中，以所需密度对电池进行补充 DMEM F12 镀板。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞24小时，让细胞附着。第14天，胶质细胞培养经历了机械分离。
观测到的星细胞群纯度为89.5%，微胶质种群纯度为96.6%。C57BL6小鼠的星形细胞和微胶质感染了T.cruzi Y.经过两小时48小时和96小时，用甲醇固定室，并染色细胞核酸酶标记DAPI和抗GFAP。使用转基因寄生虫表达荧光记者或标有特定荧光抗体的寄生虫，改善了免疫荧光显微镜，因为它们与细胞核有较好的区别。
此处介绍了两个示例。T.gondii RH菌株形成表达YFP和T.cruzi Y菌株染色的非商业单克隆抗体2C2抗SSP4蛋白。仔细清洗细胞，不要丢失任何细胞聚合体，这一点很重要。
胶质细胞感染后，可以评估其他参数，如上经剂中细胞因子生产的ELISA、蛋白质表达的西方印迹，以及RNA转录评估的实时定量PCR。与胶质细胞功能相关的许多问题，例如它们的新陈代谢、免疫反应和细胞生物学本身，都可以通过这项技术得到解决并从中受益。所有原生动物寄生虫都能够感染人类细胞和培养小鼠细胞，因此在处理这种寄生虫时要小心非常重要。
