内塞里亚淋病的金属有限生长，用于金属反应基因特征和从宿主配体中获取金属

该协议使研究人员能够分析在更密切地模仿哺乳动物宿主的条件下生长的细菌，这些宿主通过一种称为营养免疫的过程来限制金属。该协议有助于在金属受限条件下生成一致的可重复细菌生长，并可适应许多不同类型的细菌的生长。在开始实验的两天前，从冰柜库存到GC中盘的条纹高球菌在37摄氏度下孵育时间不超过24小时。

生长实验前14至16小时，将单菌落到新鲜的GC中盘上。在实验当天，在酸洗的125毫升的侧臂烧瓶中加入5至10毫升CDM，并使用此介质将Klett色度计的空白。使用无菌棉尖拭子从健康的单菌落中接种20Klet单位的CDM。

将一个健康的Neisseria淋病的亚培养剂生成到96井板中进行液体生长测定，对于所有下游实验的成功至关重要。以每分钟250转37摄氏度的培养，达到一至两个小时，直到大约一次质量翻倍，然后用足够数量的CDM稀释培养物，以达到初始培养密度的一半。然后，将文化返回到摇动的孵化器。

要准备金属加载的蛋白质，将磷化溶液加入每毫升10毫克的人类转移剂溶液，以达到30%的铁饱和度。以15%摩尔比将感兴趣的金属加入蛋白质溶液中，获得25%的饱和度。使用注射器将金属加载的蛋白质添加到透析盒中，并在室温下对两升透析缓冲液进行透析四小时。

然后，将盒式磁带移动到两升四摄氏度透析缓冲液，并在四摄氏度下通宵透析，以去除任何未绑定的金属。在质量翻倍期间，稍微稀释 10 倍与 PBS 的预混合利息。预处理96孔微孔板的井，其中15微升稀释预混合，并在三口井中每口加入10微升10倍预混合和90微升CDM，用于空白控制。

一旦侧臂烧瓶中的培养物翻倍，在微孔板中未使用的孔中添加 100 微升，并在 600 纳米时测量光学密度。在计算了将培养物以 0.02 的 600 纳米达到光学密度所需的正确稀释量后，用小培养管中的 CDM 稀释培养物，并添加足够的体积，将 10 倍预混合液稀释到板中的 1 倍。然后，将板在板读卡器中放置8至12小时，进行摇动，以所需的实验间隔以600纳米读数获得光学密度。

大规模翻倍孵育后，用三卷CDM对培养物进行回冲稀释，并添加感兴趣的金属处理。然后，在37摄氏度下孵育培养物，摇晃4小时。在四小时标记前不久，切下三片滤纸和一块硝基纤维素，以适合点斑点装置所需的大致尺寸。

将硝基纤维素在去硫化水中预浸泡约10分钟，然后用硝基纤维素下方的滤纸组装设备。在孵育结束时，记录细胞密度，将密度标准化为适当的最终密度。然后，移液细胞培养到硝基纤维素上。

当滤纸吸收了所有液体时，拆解设备，让印迹干燥。用适当的阻滞溶液阻断硝基纤维素膜一小时，并重新组装点斑点装置，用石蜡膜替换滤纸，在硝基纤维素下形成防漏密封。将感兴趣的金属结合配体稀释至阻滞剂中的0.2微摩尔，并在中等震动下探测细胞一小时。

在孵育结束时，用真空吸走液体，清洗印迹，并遵循标准的免疫程序来开发信号。西方对可变金属浓度中蛋白质生产的印迹分析揭示了对TPEN锌切合物反应锌反应外膜tdfJ的调节。当锌被加回介质时，TdfJ基本上检测不到。

N.淋病生长在锌加载的钙保护素的存在，这需要锌响应tdfH的行动。当没有可用的锌源时，生长受到限制。在锌S100 A7的存在下也观察到类似的结果，当外膜运输机tdfJ被生产时，锌S100 A7可以作为唯一的锌源。

在CDM中生长的戈诺科奇德在生产tdfH时，由于锌的稀缺性，能够结合碳保护素。在CDM中生长的培养物中，也观察到转移蛋白的结合增加，这表明，与溷合的GC肉汤相比，CDM的铁耗竭性质更高，蛋白质表达水平更高。该协议已经针对所述水源进行了优化，如果使用其他类型的水，需要与其他溷合器或金属进行额外的滴定。

对于进一步分析，可以在金属消耗或金属补充条件下进行定量金属吸收测定或定量RTPCR基因表达研究。