このプロトコルは、研究者が栄養免疫と呼ばれるプロセスを通じて金属制限されている哺乳類の宿主に見られるものをより密接に模倣する条件下で成長した細菌を分析することを可能にする。このプロトコルは、金属制限条件下での一貫した再現性細菌増殖の生成を促進し、多くの異なる種類の細菌の増殖に適合することができる。実験を開始する2日前に、冷凍庫の在庫からGC中皿にゴノコッシドを37°Cで24時間以下のインキュベーションを行う。
成長実験の14〜16時間前に、ステーキ単一コロニーを新鮮なGC培地プレートに上にする。実験当日、酸洗浄125ミリリットルのバッフルサイドアームフラスコに5~10ミリリットルのCDMを加え、この培地を使用してクレットの色素をブランクにします。滅菌綿を使用して、健康な単一コロニーからCDMの20Klett単位を接種します。
液体成長アッセイのための96ウェルプレートへのサブ培養のための健康なナイセリア淋菌接種の生成は、すべての下流実験の成功に不可欠です。初期培養密度の半分に達するのに十分な量の CDM で培養液を希釈する前に、およそ 1 質量倍になるまで 1 ~ 2 時間、1 分あたり 250 回転で 37°C で培養をインキュベートします。次いで、培養液を振る培養器に戻す。
金属を装填したタンパク質を調製するには、1ミリリットルのヒトトランスフェリン溶液に10ミリグラムのフォレーション溶液を加えて、30%鉄飽和を達成する。目的の金属を15%モル比でタンパク質溶液に加えて、25%の飽和度を得る。シリンジを使用して、金属を装填したタンパク質を透析カセットに加え、2リットルの透析バッファーに対して透析液を室温で4時間追加します。
次に、カセットを摂氏4度の透析バッファーの2リットルに移動し、一晩で4°Cで透析して、結合されていない金属を取り除きます。質量倍増の間に、PBSと関心のある10倍のプレミックスをわずかに希釈する。希釈したプレミックスの15マイクロリットルで96ウェルマイクロプレートのウェルを事前に処理し、ブランクコントロールのために3つの井戸のそれぞれに10マイクロリットルの10倍のプレミックスと90マイクロリットルのCDMを加えます。
サイドアームフラスコの培養物が2倍になったら、各培養液の100マイクロリットルをマイクロプレートの未使用の井戸に加え、600ナノメートルで光学密度を測定します。0.02の600ナノメートルで光学密度に培養をもたらすために必要な希釈量を正しく計算した後、小さい培養管のCDMで培養物を希釈し、プレート内の1Xに10倍の前入り混合物を希釈するのに十分な量を加えます。次いで、プレートをプレートリーダーに8〜12時間振盪して配置し、所望の実験間隔で600ナノメートルの測定値で光学密度を得る。
質量倍増インキュベーションの後、バックはCDMの3つのボリュームで培養物を希釈し、目的の金属処理を追加します。その後、4時間揺れで37°Cで培養します。4時間のマークの少し前に、3枚の濾紙とニトロセルロースをドットブロット装置に収めるのに必要なおおよその大きさに切った。
ニトロセルロースを脱イオン水に約10分間あらかじめ浸し、ニトロセルロースの下にろ紙で装置を組み立てます。インキュベーションの最後に、細胞密度を記録し、適切な最終密度に密度を標準化します。次いで、細胞培養物をニトロセルロース上にピペットする。
濾紙が液体のすべてを吸収した場合は、装置を分解し、ブロットを乾燥させます。ニトロセルロース膜を適切なブロッキング溶液で1時間ブロックし、ドットブロット装置を再組み立て、フィルターペーパーをパラフィンフィルムに置き換えてニトロセルロースの下に漏れ防止シールを作成する。目的の金属結合リガンドをブロッカーで0.2マイクロモルに希釈し、適度な揺れで細胞を1時間プローブします。
インキュベーションの終わりに、液体を真空で吸い取り、ブロットを洗浄し、標準的な免疫学的手順に従って信号を発達させる。可変金属濃度におけるタンパク質産生のウェスタンブロット分析は、TPENによる亜鉛キレートに応答して亜鉛応答性外膜tdfJの調節を明らかにする。TdfJは、亜鉛を培地に添加して戻すと、本質的に検出できない。
N.淋菌は、亜鉛応答性tdfHの作用を必要とする亜鉛装填されたカルプロテクチンの存在下で成長する。使用可能な亜鉛源がない場合、成長は制限されます。同様の結果は、外膜輸送体tdfJが産生されるときに唯一の亜鉛源として機能することができる亜鉛S100 A7の存在下で観察される。
CDMで栽培されたゴノコチドは、tdfHを産生するとき、および亜鉛不足の結果としてカルプロテクチンを結合することができる。トランスフェリンの結合の増加は、CDMで増殖した培養物においても観察され、キレートされたGCブロスと比較して、CDMの鉄の枯渇性が高いため、タンパク質発現のレベルが高いことを示す。このプロトコルは、記載の水源での使用のために最適化されており、他の種類の水が使用される場合は、他のキレートまたは金属との追加の滴定が必要になります。
追加の分析のために、金属枯渇または金属整体条件下での遺伝子発現試験のための定量的な金属取り込みアッセイまたは定量RTPCRを行うことができる。
