Questo protocollo consente ai ricercatori di analizzare i batteri coltivati in condizioni che imitano più da vicino quelli trovati in un ospite di mammiferi, che sono metallo limitato attraverso un processo chiamato immunità nutrizionale. Questo protocollo facilita la generazione di una crescita batterica riproducibile coerente in condizioni limitate di metallo e può essere adattato per la crescita di molti tipi diversi di batteri. Due giorni prima di iniziare l'esperimento, striscia gonococcide dalle scorte di congelatori su piastre medie GC per un'incubazione non superiore a 24 ore a 37 gradi Celsius.
Da 14 a 16 ore prima dell'esperimento di crescita, bistecca colonie singole su piatti medi GC freschi. Il giorno dell'esperimento, aggiungere da cinque a 10 millilitri CDM a un pallone laterale sconcertato da 125 millilitri lavato con acido e utilizzare questo mezzo per sganciare un colorimetro Klett. Utilizzare un tampone sterile con punta di cotone per inoculare 20 unità Klett di CDM da singole colonie sane.
La generazione di un inoculo neisseria gonorrhoeae sano per la sottocoltura nelle 96 piastre del pozzo per i test di crescita liquida è fondamentale per il successo di tutti gli esperimenti a valle. Incubare le colture a 37 gradi Celsius in 250 giri al minuto per una o due ore fino ad approssimare un raddoppio di massa prima di diluire le colture con un volume sufficiente di CDM per raggiungere la metà della densità di coltura iniziale. Quindi, riportare la cultura all'incubatrice tremante.
Per preparare proteine caricate in metallo, aggiungere la soluzione di foazione a una soluzione di transferrina umana da 10 milligrammi per millilitro per ottenere una saturazione del ferro del 30%. Aggiungere il metallo di interesse alla soluzione proteica con un rapporto molare del 15% per ottenere una saturazione del 25%. Utilizzare una siringa per aggiungere la proteina caricata in metallo a una cassetta di dialisi e dializzare contro due litri di tampone di dialisi per quattro ore a temperatura ambiente.
Quindi, spostare la cassetta a due litri di tampone di dialisi Celsius di quattro gradi Celsius e dializzare durante la notte a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali metalli non legati. Durante il raddoppio di massa, diluire leggermente i pre-mix 10X di interesse con PBS. Pre-trattare i pozzi di una micropiatta da 96 pozzetti con 15 microlitri dei premismi diluiti e aggiungere 10 microlitri di pre-mix 10X e 90 microlitri di CDM a ciascuno dei tre pozzi per i controlli vuoti.
Una volta raddoppiate le colture nel pallone del braccio laterale, aggiungere 100 microlitri di ogni coltura a un pozzo inutilizzato nella micropiastrina e misurare la densità ottica a 600 nanometri. Dopo aver calcolato la corretta quantità di diluizione necessaria per portare le colture a una densità ottica a 600 nanometri di 0,02, diluire le colture con CDM in piccoli tubi di coltura e aggiungere un volume sufficiente per diluire i pre-mix 10X a 1X nella piastra. Quindi, posizionare la piastra in un lettore di lastre per otto-12 ore con scuotimento per ottenere densità ottica a letture di 600 nanometri agli intervalli sperimentali desiderati.
Dopo l'incubazione del raddoppio di massa, diluire le colture con tre volumi di CDM e aggiungere i trattamenti metallici di interesse. Quindi, incubare le colture a 37 gradi Celsius tremando per quattro ore. Poco prima del segno delle quattro ore, tagliare tre pezzi di carta da filtro e un pezzo di nitrocellulosa alle dimensioni approssimative necessarie per adattarsi a un apparato a macchie di punti.
Pre-immergere la nitrocellulosa in acqua deionizzata per circa 10 minuti prima di assemblare l'apparecchio con carta filtrante sotto la nitrocellulosa. Al termine dell'incubazione, registrare le densità cellulari e standardizzare le densità ad una densità finale appropriata. Quindi, pipettare le colture cellulari sulla nitrocellulosa.
Quando la carta filtrante ha assorbito tutto il liquido smontare l'apparecchio e lasciare asciugare la macchia. Bloccare la membrana di nitrocellulosa per un'ora con un'appropriata soluzione di blocco e riassemblare l'apparato a macchie di punti, sostituendo la carta filtrante con pellicola di paraffina per creare un sigillo a prova di perdite sotto la nitrocellulosa. Diluire il ligando legante metallico di interesse a 0,2 micromolare nel bloccante e sondare le cellule per un'ora con moderato scuotimento.
Alla fine dell'incubazione, sifonare il liquido con un vuoto, lavare la macchia e seguire le procedure immunologiche standard per sviluppare il segnale. L'analisi western della produzione di proteine in concentrazioni metalliche variabili rivela una regolazione della membrana esterna reattiva allo zinco tdfJ in risposta alla chelazione dello zinco da parte del TPEN. TdfJ è essenzialmente non rilevabile quando lo zinco viene aggiunto di nuovo al mezzo.
N.gonorrhoeae cresce in presenza di calprotectina carica di zinco, che richiede l'azione del tdfH reattivo allo zinco. Quando non è disponibile alcuna fonte di zinco utilizzabile, la crescita è limitata. Risultati simili si osservano in presenza di zinco S100 A7, che può servire come unica fonte di zinco quando viene prodotto il trasportatore esterno a membrana, tdfJ.
I gonococchidi coltivati in CDM sono in grado di legare la calprotectina durante la produzione di tdfH e come risultato della scarsità di zinco. Un aumento del legame della transferrina si osserva anche nelle colture coltivate in CDM, indicative di livelli più elevati di espressione proteica a causa della natura più esaurita del CDM rispetto al brodo GC chelato. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con le fonti d'acqua descritte e sarà necessaria una titolazione aggiuntiva con altri chelatori o metalli se vengono utilizzati altri tipi di acqua.
Per ulteriori analisi, si potrebbero eseguire saggi quantitativi di assorbimento dei metalli o RTPCR quantitativo per studi di espressione genica in condizioni di esaurimento del metallo o di esaurimento del metallo.
