Este protocolo permite a los investigadores analizar las bacterias cultivadas en condiciones que imitan más estrechamente a las que se encuentran en un huésped de mamíferos, que son metales limitados a través de un proceso llamado inmunidad nutricional. Este protocolo facilita la generación de un crecimiento bacteriano reproducible consistente en condiciones restringidas por metales y puede adaptarse para el crecimiento de muchos tipos diferentes de bacterias. Dos días antes de comenzar el experimento, raya el gonococcida de las existencias de congelador en placas medianas GC durante una incubación no más de 24 horas a 37 grados centígrados.
14 a 16 horas antes del experimento de crecimiento, bistec colonias individuales en platos medianos GC frescos. El día del experimento, añada de cinco a 10 mililitros CDM a un matraz de brazo lateral lavado con ácido de 125 mililitros y utilice este colorímetro Klett de medio a blanco. Utilice un hisopo con punta de algodón estéril para inocular 20 unidades Klett de CDM de colonias individuales sanas.
La generación de un inóculo de Neisseria gonorrhoeae saludable para la subcultura en las 96 placas de pozo para ensayos de crecimiento líquido es fundamental para el éxito de todos los experimentos posteriores. Incubar las culturas a 37 grados centígrados en 250 revoluciones por minuto durante una a dos horas hasta aproximadamente una misa antes de diluir los cultivos con un volumen suficiente de MDL para alcanzar la mitad de la densidad de cultivo inicial. Luego, devuelve la cultura a la incubadora de temblores.
Para preparar proteínas cargadas de metal, agregue la solución de fotración a una solución de transferrina humana de 10 miligramos por mililitro para lograr una saturación de hierro del 30%. Añadir el metal de interés a la solución proteica en una proporción molar del 15% para obtener una saturación del 25%. Utilice una jeringa para agregar la proteína cargada de metal a un casete de diálisis y dializar contra dos litros de tampón de diálisis durante cuatro horas a temperatura ambiente.
A continuación, mueva el cassette a dos litros de cuatro grados Celsius diálisis buffer y dialyze durante la noche a cuatro grados Celsius para eliminar los metales sin ataduras. Durante la duplicación en masa, diluir ligeramente 10X premezclas de interés con PBS. Pretrateja los pomos de una microplaca de 96 pozos con 15 microlitros de las premezclas diluidas y añada 10 microlitros de premezcla 10X y 90 microlitros de CDM a cada uno de los tres pozos para los controles en blanco.
Una vez que los cultivos en el matraz del brazo lateral se hayan duplicado, añadir 100 microlitros de cada cultivo a un pozo no utilizado en la microplaca y medir la densidad óptica a 600 nanómetros. Después de calcular la cantidad correcta de dilución necesaria para llevar los cultivos a una densidad óptica a 600 nanómetros de 0,02, diluir los cultivos con CDM en pequeños tubos de cultivo y añadir un volumen suficiente para diluir las premezclas 10X a 1X en la placa. A continuación, coloque la placa en un lector de placas durante ocho a 12 horas con agitación para obtener densidad óptica a 600 nanómetros de lectura a los intervalos experimentales deseados.
Después de la incubación de duplicación en masa, volver a diluir los cultivos con tres volúmenes de MDL y añadir los tratamientos metálicos de interés. Luego, incubar las culturas a 37 grados centígrados con temblores durante cuatro horas. Poco antes de la marca de cuatro horas, corte tres trozos de papel de filtro y un pedazo de nitrocelulosa al tamaño aproximado necesario para caber en un aparato de punto-blot.
Pre-remojar la nitrocelulosa en agua desionizada durante unos 10 minutos antes de ensamblar el aparato con papel de filtro debajo de la nitrocelulosa. Al final de la incubación, registre las densidades celulares y estandarice las densidades a una densidad final adecuada. Luego, pipetea los cultivos celulares sobre la nitrocelulosa.
Cuando el papel de filtro haya absorbido todo el líquido desmonte el aparato y deje que la mancha se seque. Bloquee la membrana de nitrocelulosa durante una hora con una solución de bloqueo adecuada y vuelva a montar el aparato de punto-blot, reemplazando el papel de filtro con película de parafina para crear un sello a prueba de fugas bajo la nitrocelulosa. Diluir el ligando metálico de interés a 0,2 micromolares en bloqueador y sondear las células durante una hora con agitación moderada.
Al final de la incubación, sifón del líquido con un vacío, lavar la mancha, y seguir los procedimientos inmunológicos estándar para desarrollar la señal. El análisis de manchas occidentales de la producción de proteínas en concentraciones de metales variables revela la regulación de la membrana exterior sensible al zinc tdfJ en respuesta a la quelación de zinc por TPEN. TdfJ es esencialmente indetectable cuando se agrega zinc de nuevo al medio.
N.gonorrhoeae crece en presencia de calprotectina cargada de zinc, lo que requiere la acción de la tdfH sensible al zinc. Cuando no se dispone de una fuente de zinc utilizable, el crecimiento está restringido. Se observan resultados similares en presencia de zinc S100 A7, que puede servir como una única fuente de zinc cuando se produce el transportador de membrana externa, tdfJ.
El gonococcida cultivado en MDL es capaz de unir la calprotectina al producir tdfH y como resultado de la escasez de zinc. También se observa un aumento de la unión de transferrina en cultivos cultivados en MDL, indicativo de mayores niveles de expresión proteica debido a la naturaleza más agotada del hierro de la MDL en comparación con el caldo de GC quelado. Este protocolo ha sido optimizado para su uso con las fuentes de agua descritas y se necesitará una valoración adicional con otros quelantes o metales si se utilizan otros tipos de agua.
Para análisis adicionales, se podrían realizar ensayos cuantitativos de absorción de metales o RTPCR cuantitativo para estudios de expresión génica en condiciones de agotamiento de metales o de reposición de metales.
