Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Bakterien zu analysieren, die unter Bedingungen angebaut werden, die denen in einem Säugetierwirt näher nachahmen, die durch einen Prozess, der als Ernährungsimmunität bezeichnet wird, metallisch begrenzt sind. Dieses Protokoll erleichtert die Erzeugung eines konsistenten reproduzierbaren Bakterienwachstums unter metallbeschränkten Bedingungen und kann für das Wachstum vieler verschiedener Bakterienarten angepasst werden. Zwei Tage vor Beginn des Experiments, Streifen Gonokokziden von Gefriervorräten auf GC Mittelplatten für eine nicht mehr als 24 Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius.
14 bis 16 Stunden vor dem Wachstumsexperiment Steak einzelne Kolonien auf frischen GC-Mittelplatten. Am Tag des Experiments fünf bis 10 Milliliter CDM zu einem säuregewaschenen 125 Milliliter verwirrten Seitenarmkolben hinzufügen und dieses Medium verwenden, um ein Klett-Kolorimeter auszublenden. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um 20 Klett-Einheiten CDM aus gesunden Einzelkolonien zu impfen.
Die Generierung eines gesunden Neisseria gonorrhoeae inoculum für subkultur in die 96 Brunnenplatten für Flüssigwachstumstests ist entscheidend für den Erfolg aller nachgelagerten Experimente. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius in 250 Umdrehungen pro Minute für ein bis zwei Stunden, bis ungefähr eine Massenverdoppelung vor der Verdünnung der Kulturen mit einem ausreichenden CDM-Volumen, um die Hälfte der ursprünglichen Kulturdichte zu erreichen. Dann kehren Sie die Kultur zum zitternden Brutkasten zurück.
Um metallbelastete Proteine herzustellen, fügen Sie eine Phorationslösung zu einer 10 Milligramm pro Milliliter menschlicher Transferrinlösung hinzu, um 30% Eisensättigung zu erreichen. Fügen Sie das von Interesse sindde Metall in einem Verhältnis von 15% in molaren Wert der Proteinlösung hinzu, um eine 25%Sättigung zu erhalten. Verwenden Sie eine Spritze, um das mit Metall belastete Protein einer Dialysekassette hinzuzufügen und bei Raumtemperatur vier Stunden lang gegen zwei Liter Dialysepuffer zu dialysieren.
Dann bewegen Sie die Kassette auf zwei Liter von vier Grad Celsius Dialysepuffer und Dialyse über Nacht bei vier Grad Celsius, um alle ungebundenen Metalle zu entfernen. Während der Massenverdoppelung, leicht verdünnen 10X Pre-Mixes von Interesse mit PBS. Behandeln Sie die Bohrungen einer 96-Well-Mikroplatte mit 15 Mikrolitern der verdünnten Vormischungen vor und fügen Sie 10 Mikroliter 10-fachen Pre-Mix und 90 Mikroliter CDM zu jeder der drei Bohrungen für die Blankosaugen hinzu.
Sobald sich die Kulturen im Seitenarmkolben verdoppelt haben, fügen Sie 100 Mikroliter jeder Kultur zu einem ungenutzten Brunnen in der Mikroplatte hinzu und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern. Nach der Berechnung der korrekten Verdünnungsmenge, die erforderlich ist, um die Kulturen auf eine optische Dichte von 600 Nanometern von 0,02 zu bringen, verdünnen Sie die Kulturen mit CDM in kleinen Kulturröhren und fügen Sie ein ausreichendes Volumen hinzu, um die 10-fachen Vormischungen auf das 1-fache in der Platte zu verdünnen. Legen Sie die Platte dann acht bis zwölf Stunden lang in einen Plattenleser mit Schütteln, um in den gewünschten versuchsweise Intervallen eine optische Dichte bei 600 Nanometern Messwerten zu erhalten.
Nach der Massenverdoppelung Inkubation, zurück verdünnen die Kulturen mit drei Bänden CDM und fügen Sie die Metallbehandlungen von Interesse. Dann bebrüten die Kulturen bei 37 Grad Celsius mit Schütteln für vier Stunden. Kurz vor der Vier-Stunden-Marke drei Stück Filterpapier und ein Stück Nitrocellulose auf die ungefähre Größe schneiden, die benötigt wird, um in ein Punkt-Blot-Gerät zu passen.
Die Nitrocellulose in entionisiertem Wasser ca. 10 Minuten vorträglich einweichen, bevor das Gerät mit Filterpapier unter der Nitrocellulose montiert wird. Zeichnen Sie am Ende der Inkubation die Zelldichten auf und standardisieren Sie die Dichte auf eine angemessene Enddichte. Dann pipette die Zellkulturen auf die Nitrocellulose.
Wenn das Filterpapier die gesamte Flüssigkeit absorbiert hat, zerlegt das Gerät und lässt den Fleck trocknen. Blockieren Sie die Nitrozellulosemembran für eine Stunde mit einer geeigneten Blockierlösung und montieren Sie das Dot-Blot-Gerät wieder zusammen, indem Sie das Filterpapier durch Paraffinfolie ersetzen, um eine leckdichte Dichtung unter der Nitrocellulose zu erzeugen. Den metallenen Bindungsligand von Interesse auf 0,2 Mikromolar im Blocker verdünnen und die Zellen eine Stunde lang mit moderatem Schütteln untersuchen.
Am Ende der Inkubation die Flüssigkeit mit einem Vakuum absaugen, den Fleck waschen und den üblichen immunologischen Verfahren folgen, um das Signal zu entwickeln. Die Western Blot-Analyse der Proteinproduktion in variablen Metallkonzentrationen zeigt eine Regulierung der zinkempfindlichen äußeren Membran tdfJ als Reaktion auf die Zinkchelatation durch TPEN. TdfJ ist im Wesentlichen nicht nachweisbar, wenn Zink wieder dem Medium zugesetzt wird.
N.gonorrhoeae wächst in Gegenwart von zinkbelastetem Calprotectin, was die Wirkung des zinkreagierenden tdfH erfordert. Wenn keine verwendbare Zinkquelle verfügbar ist, ist das Wachstum eingeschränkt. Ähnliche Ergebnisse werden in Gegenwart von Zink S100 A7 beobachtet, das als einzige Zinkquelle dienen kann, wenn der äußere Membrantransporter tdfJ hergestellt wird.
Gonokokzid, das in CDM angebaut wird, ist in der Lage, Calprotectin bei der Herstellung von tdfH und als Folge der Zinkknappheit zu binden. Erhöhte Bindung von Transferrin wird auch in Kulturen beobachtet, die in CDM angebaut werden, was auf eine höhere Proteinexpression aufgrund der stärker eisenabbauigen Natur von CDM im Vergleich zu chelatierter GC-Brühe hindeutet. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz mit den beschriebenen Wasserquellen optimiert und zusätzliche Titration mit anderen Chelatoren oder Metallen wird benötigt, wenn andere Wasserarten verwendet werden.
Für zusätzliche Analysen könnte man quantitative Metallaufnahmetests oder quantitative RTPCR für Genexpressionsstudien unter Metallabbau- oder Metall-Relete-Bedingungen durchführen.
