Ce protocole permet aux chercheurs d’analyser les bactéries cultivées dans des conditions qui imitent plus étroitement celles trouvées dans un hôte mammifère, qui sont des métaux limités par un processus appelé immunité nutritionnelle. Ce protocole facilite la génération d’une croissance bactérienne reproductible cohérente dans des conditions métalliques restreintes et peut être adapté à la croissance de nombreux types de bactéries. Deux jours avant le début de l’expérience, stries gonococcide des stocks de congélateur sur les plaques moyennes GC pour une incubation pas plus de 24 heures à 37 degrés Celsius.
14 à 16 heures avant l’expérience de croissance, steak colonies simples sur des assiettes moyennes fraîches GC. Le jour de l’expérience, ajouter de cinq à 10 millilitres de MDP à un flacon de bras latéral déconcerté de 125 millilitres lavé à l’acide et utiliser ce milieu pour vider un colorimètre Klett. Utilisez un écouvillon stérile à pointe de coton pour inoculer 20 unités Klett de MDP provenant de colonies individuelles saines.
La génération d’un inoculum de Neisseria gonorrhoeae sain pour la sous-culture dans les 96 plaques de puits pour les analyses de croissance liquide est essentielle au succès de toutes les expériences en aval. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius en 250 révolutions par minute pendant une à deux heures jusqu’à ce qu’environ une masse double avant de diluer les cultures avec un volume suffisant de MDP pour atteindre la moitié de la densité de culture initiale. Ensuite, retournez la culture à l’incubateur qui tremble.
Pour préparer des protéines chargées de métal, ajoutez une solution de phoration à une solution de transferrine humaine de 10 milligrammes par millilitre pour atteindre une saturation en fer de 30 %. Ajoutez le métal d’intérêt à la solution protéique à un rapport molaire de 15% pour obtenir une saturation de 25%. Utilisez une seringue pour ajouter la protéine chargée de métal à une cassette de dialyse et dialysez contre deux litres de tampon de dialyse pendant quatre heures à température ambiante.
Ensuite, déplacez la cassette à deux litres de tampon de dialyse de quatre degrés Celsius et dialysez pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour enlever les métaux non liés. Pendant le doublement de masse, diluer légèrement 10X pré-mélanges d’intérêt avec PBS. Pré-traiter les puits d’une microplaque de puits 96 avec 15 microlitres des pré-mélanges dilués et ajouter 10 microlitres de pré-mélange 10X et 90 microlitres de MDP à chacun des trois puits pour les contrôles vierges.
Une fois que les cultures dans le flacon latéral ont doublé, ajouter 100 microlitres de chaque culture à un puits inutilisé dans la microplaque et mesurer la densité optique à 600 nanomètres. Après avoir calculé la quantité correcte de dilution nécessaire pour amener les cultures à une densité optique à 600 nanomètres de 0,02, diluer les cultures avec le MDP dans de petits tubes de culture et ajouter un volume suffisant pour diluer les pré-mélanges 10X à 1X dans la plaque. Ensuite, placez la plaque dans un lecteur de plaque pendant huit à 12 heures en secouant pour obtenir une densité optique à 600 nanomètres de lectures aux intervalles expérimentaux désirés.
Après le doublement de masse de l’incubation, le dos diluer les cultures avec trois volumes de MDP et ajouter les traitements métalliques d’intérêt. Puis, incuber les cultures à 37 degrés Celsius avec des secousses pendant quatre heures. Peu de temps avant la marque de quatre heures, couper trois morceaux de papier filtre et un morceau de nitrocellulose à la taille approximative nécessaire pour s’insérer dans un appareil point-tache.
Prétremper la nitrocellulose dans de l’eau déionisée pendant environ 10 minutes avant d’assembler l’appareil avec du papier filtre sous la nitrocellulose. À la fin de l’incubation, enregistrer les densités cellulaires et normaliser les densités à une densité finale appropriée. Ensuite, pipette les cultures cellulaires sur la nitrocellulose.
Lorsque le papier filtre a absorbé tout le liquide démonter l’appareil et laisser sécher la tache. Bloquez la membrane de nitrocellulose pendant une heure avec une solution de blocage appropriée et remontez l’appareil point-tache, remplaçant le papier filtre par du film de paraffine pour créer un joint anti-fuite sous la nitrocellulose. Diluer le ligand de liaison métallique d’intérêt à 0,2 micromolaire dans le bloqueur et sonder les cellules pendant une heure avec des secousses modérées.
À la fin de l’incubation, siphonner le liquide avec un vide, laver la tache et suivre les procédures immunologiques standard pour développer le signal. L’analyse occidentale de tache de la production de protéine dans les concentrations variables de métal indique la régulation du tdfJ externe sensible de membrane sensible au zinc en réponse à la chélation de zinc par TPEN. TdfJ est essentiellement indétectable lorsque le zinc est ajouté au milieu.
N.gonorrhoeae pousse en présence de calprotectine chargée de zinc, ce qui nécessite l’action du tdfH sensible au zinc. Lorsqu’aucune source de zinc utilisable n’est disponible, la croissance est limitée. Des résultats similaires sont observés en présence du zinc S100 A7, qui peut servir de seule source de zinc lorsque le transporteur de membrane externe, tdfJ, est produit.
Le gonococcide cultivé en MDP est capable de lier la calprotectine lors de la production de tdfH et en raison de la rareté du zinc. Une liaison accrue de la transferrine est également observée dans les cultures cultivées en MDP, ce qui indique des niveaux plus élevés d’expression protéique en raison de la nature plus appauvrie en fer du MDP par rapport au bouillon chélifié GC. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec les sources d’eau décrites et la titration supplémentaire avec d’autres chélateurs ou métaux sera nécessaire si d’autres types d’eau sont utilisés.
Pour une analyse supplémentaire, on pourrait effectuer des tests quantitatifs d’absorption des métaux ou rtpcr quantitatif pour les études d’expression génétique dans des conditions d’épuisement des métaux ou d’absorption de métaux.
