이 프로토콜은 연구원이 영양 면역이라고 칭하는 프로세스를 통해 제한되는 포유류 호스트에서 찾아낸 박테리아를 더 밀접하게 모방하는 조건하에서 성장한 박테리아를 분석할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 금속 제한 조건하에서 일관된 재현 가능한 세균 성장의 생성을 용이하게하고 박테리아의 많은 다른 모형의 성장을 위해 적응될 수 있습니다. 실험을 시작하기 이틀 전에 냉동고 재고에서 고노코시드를 GC 중간 플레이트에 37°C에서 24시간 이상 배양할 수 있습니다.
성장 실험 14~16시간 전에 스테이크 싱글 콜로니를 신선한 GC 중간 접시에 담는다. 실험 당일, 산세척 125 밀리리터 당황사이드 암 플라스크에 5~10밀리리터 CDM을 추가하고 이 매체를 사용하여 Klett 색도계를 비우세요. 멸균 면봉을 사용하여 건강한 단일 콜로니에서 CDM 20 Klett 유닛을 접종하십시오.
액체 성장 실험을 위한 96웰 플레이트로 서브컬쳐를 위한 건강한 Neisseria 임질 접종의 생성은 모든 다운스트림 실험의 성공에 매우 중요합니다. 초기 배양 밀도의 절반에 도달하기에 충분한 양의 CDM으로 문화를 희석하기 전에 1~2시간 동안 분당 250도의 회전에서 37도의 배양문화가 1~2시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 흔들리는 인큐베이터에 문화를 반환합니다.
금속 적재 단백질을 준비하려면 밀리리터 인간 이송용액당 10밀리그램에 인레이션 용액을 추가하여 30%의 철 포화를 달성합니다. 25%의 포화도를 얻기 위해 15%의 어금니 비율로 단백질 용액에 관심 있는 금속을 추가합니다. 주사기를 사용하여 투석 카세트에 금속적으로 적재된 단백질을 추가하고 실온에서 4시간 동안 투석 버퍼 2리터에 투석합니다.
그런 다음 카세트를 섭씨 4도의 2리터로 이동하고 섭씨 4도에서 밤새 투석을 하여 언바운드 금속을 제거합니다. 질량 두 배로 하는 동안, 약간 희석 10 X PBS와 관심의 사전 혼합. 희석 된 프리 믹스의 15 마이크로 리터와 96 잘 마이크로 플레이트의 우물을 사전 처리하고 빈 컨트롤을위한 세 개의 우물 각각에 10 X 사전 혼합 및 90 마이크로 리터의 10 마이크로 리터를 추가합니다.
측면 팔 플라스크의 배양이 두 배가되면 각 배양의 100 마이크로리터를 마이크로 플레이트에서 사용하지 않은 우물에 추가하고 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 배양을 600나노미터002의 광학 밀도로 가져오는 데 필요한 정확한 희석량을 계산한 후, 작은 배양 튜브에서 CDM으로 배양을 희석하고 10X 프리 믹스를 플레이트내의 1X로 희석시키기에 충분한 부피를 첨가한다. 이어서, 원하는 실험 간격으로 600 나노미터 판독값에서 광학 밀도를 얻기 위해 흔들림과 함께 8 내지 12시간 동안 플레이트 판독기에 플레이트를 배치한다.
질량 배양 후, 다시 CDM의 세 볼륨으로 문화를 희석하고 관심의 금속 처리를 추가합니다. 그런 다음, 4 시간 동안 흔들어와 섭씨 37도에서 문화를 배양. 4시간 표시 직전에, 도트 블롯 장치에 들어가는 데 필요한 대략적인 크기로 필터 용지 3장과 니트로셀룰로오스 조각을 잘라냅니다.
니트로셀룰로오스 아래에 필터 종이로 장치를 조립하기 전에 약 10 분 동안 산화 된 물에 니트로 셀룰로오스를 미리 담급하십시오. 인큐베이션의 끝에서 세포 밀도를 기록하고 밀도를 적절한 최종 밀도로 표준화합니다. 그런 다음, 니트로셀룰로오스에 세포 배양을 피펫.
필터 용지가 모든 액체를 흡수하면 장치를 분해하고 얼룩이 건조할 수 있습니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 적절한 차단 용액으로 1시간 동안 차단하고 도트 블롯 장치를 재조립하여 필터 용지를 파라핀 필름으로 교체하여 니트로셀룰로오스 아래에 누설 방지 씰을 만듭니다. 관심있는 금속 결합 리간드를 블로커에서 0.2 마이크로 몰라로 희석하고 적당한 흔들림으로 1 시간 동안 세포를 조사하십시오.
인큐베이션이 끝나면 진공으로 액체를 벗겨 내고, 블롯을 씻고, 표준 면역 학적 절차를 따라 신호를 개발합니다. 가변 금속 농도에서 단백질 생산의 서양 블롯 분석은 TPEN에 의한 아연 킬레이션에 대한 응답으로 아연 반응 외부 멤브레인 tdfJ의 조절을 드러낸다. TdfJ는 아연을 매체에 다시 추가할 때 본질적으로 감지할 수 없습니다.
N.임질은 아연 반응 tdfH의 작용을 필요로 아연로드 칼 프로핀의 존재에서 성장한다. 사용 가능한 아연 소스를 사용할 수 없는 경우 성장이 제한됩니다. 외부 멤브레인 수송기, tdfJ가 생성될 때 단독 아연 원천으로 작용할 수 있는 아연 S100 A7의 존재에서 유사한 결과가 관찰된다.
CDM에서 자란 고노코치데는 tdfH를 생산할 때와 아연 희소성의 결과로 칼보호딘을 묶을 수 있습니다. 전달린의 증가된 결합은 또한 CDM에서 성장하는 배양에서 관찰되며, 이는 CM의 철고가 고갈된 특성으로 인해 더 높은 수준의 단백질 발현을 나타내는 데 비하여 C. 이 프로토콜은 설명된 수원과 함께 사용하도록 최적화되었으며 다른 유형의 물을 사용하는 경우 다른 첼레이터 또는 금속과의 추가 적정이 필요합니다.
추가 분석을 위해, 하나는 금속 고갈 또는 금속 충만 조건하에서 유전자 발현 연구를 위한 정량적 금속 섭취 분석 또는 정량적 RTPCR을 수행할 수 있었다.
