Этот протокол позволяет исследователям анализировать бактерии, выращенные в условиях, которые более тесно имитируют те, которые находятся в млекопитающих хозяина, которые металла ограничены через процесс, называемый питательный иммунитет. Этот протокол облегчает генерацию последовательного воспроизводимого роста бактерий в условиях ограниченных металлических условий и может быть адаптирован для роста различных типов бактерий. За два дня до начала эксперимента полоса гонококцида из морозильных запасов на GC средних пластин для не более 24 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию.
За 14-16 часов до начала эксперимента по росту стейк одиночные колонии на свежие средние пластины GC. В день эксперимента добавьте от пяти до 10 миллилитров CDM в промытую кислотой 125 миллилитр сбитую с толку боковую колбу и используйте эту среду для того, чтобы очистить колорит Клетта. Используйте стерильный хлопок наконечником тампона, чтобы привить 20 Klett единиц CDM из здоровых одиночных колоний.
Поколение здорового Neisseria gonorrhoeae inoculum для субкультуры в 96 пластин для анализа жидкого роста имеет решающее значение для успеха всех экспериментов вниз по течению. Инкубировать культур на 37 градусов по Цельсию в 250 оборотов в минуту в течение одного-двух часов, пока приблизительные одной массы удвоения до разбавления культур с достаточным объемом CDM достичь половины первоначальной плотности культуры. Затем верните культуру в трясусь инкубатор.
Для приготовления металлических заряженных белков добавьте растворфорации в раствор 10 миллиграмм на миллилитр человеческого трансферрина для достижения 30%насыщенности железом. Добавьте металл интереса к раствору протеина на соотношении 15%molar для того чтобы получить 25%saturation. Используйте шприц, чтобы добавить металлический заряженный белок в кассету диализа и диализа против двух литров буфера диализа в течение четырех часов при комнатной температуре.
Затем переместите кассету на два литра буфера диализа по цельсию на два литра по Цельсию и облизой на ночь при четырех градусах цельсия, чтобы удалить любые несъебленные металлы. Во время массового удвоения, слегка разбавить 10X пре-миксы интереса с PBS. Предварительно обработать скважины 96 колодца микропластиной с 15 микролитров разбавленных пре-миксов и добавить 10 микролитров 10X предварительной смеси и 90 микролитров CDM для каждой из трех скважин для пустого управления.
После того, как культуры в боковой колбе удвоились, добавьте 100 микролитров каждой культуры к неиспользованной плите в микропластине и измерьте оптическую плотность на 600 нанометров. После расчета правильного количества разбавления, необходимого для приведения культур к оптической плотности на 600 нанометров 0,02, разбавить культуры с CDM в малых труб культуры и добавить достаточный объем, чтобы разбавить 10X пре-миксы до 1X в пластине. Затем поместите пластину в считыватель пластин в течение восьми-12 часов с встряхивания для получения оптической плотности на 600 нанометров показания на желаемых экспериментальных интервалов.
После массового удвоения инкубации, обратно разбавить культур с тремя томами CDM и добавить металлические обработки интерес. Затем инкубировать культуры при 37 градусов по Цельсию с встряхивания в течение четырех часов. Незадолго до четырехчасовой отметки вырежьте три куска фильтровальной бумаги и кусок нитроцеллюлозы до приблизительного размера, необходимого для вписываться в точечный аппарат.
Предварительно замочите нитроцеллюлозы в деионизированной воде в течение 10 минут, прежде чем собирать аппарат с фильтровальной бумагой ниже нитроцеллюлозы. В конце инкубации завехайте плотность клеток и стандартизируйте плотность до соответствующей конечной плотности. Затем пипетка клеточных культур на нитроцеллюлозы.
Когда фильтровающая бумага впитала всю жидкость, разочистите аппарат и дайте помарке высохнуть. Блокируйте мембрану нитроцеллюлозы в течение одного часа с соответствующим блокирующим раствором и сохотвествуйте точечный аппарат, заменив фильтровальную бумагу парафиновой пленкой, чтобы создать уплотнение доказательства утечки под нитроцеллюлозой. Разбавить металлический связывающий лиганд интереса к 0,2 микромоляра в блокаторе и зондировать клетки в течение одного часа с умеренной тряской.
В конце инкубации сифон откачивайте жидкость с помощью вакуума, вымойте помарку и следуйте стандартным иммунологическим процедурам для разработки сигнала. Западный анализ помарки продукции протеина в переменных концентрациях металла показывает вверх регулировку цинка отзывчивого наружного tdfJ мембраны в ответ на chelation цинка TPEN. TdfJ по существу обнаружить, когда цинк добавляется обратно в среду.
N.gonorrhoeae растет в присутствии цинка загружены кальпротектина, который требует действия цинка реагировать tdfH. При наличии доступного источника цинка рост ограничен. Аналогичные результаты наблюдаются в присутствии цинка S100 A7, который может служить единственным источником цинка при изготовлении внешнего мембранного транспортера tdfJ.
Гонокококсид, выращенный в CDM, способен связывать кальпротектин при производстве tdfH и в результате дефицита цинка. Повышенная привязка трансферрина наблюдается также в культурах, выращенных в CDM, что свидетельствует о более высоких уровнях экспрессии белка из-за более истощенного железа характера CDM по сравнению с chelated бульоном GC. Этот протокол был оптимизирован для использования с описанными источниками воды и дополнительные titration с другими chelators или металлов будет необходимо, если другие виды воды используются.
Для дополнительного анализа можно было бы выполнить количественные анализы поглощения металла или количественные RTPCR для исследования экспрессии генов в условиях истощения металла или металла.
