通过免疫荧光简单检测原发性西莉亚

该协议允许在各种研究努力中快速轻松地检测培养细胞中的原发性西莉亚。该方法可用于影响原发性西莉亚基体的混乱。此过程还可用于在石蜡嵌入组织中染色原发性西莉亚，或用于需要荧光的其他实验。

首先，用高压灭22毫米盖滑，为实验准备材料。解冻FBS和青霉素链霉素，并温暖培养中室温度。通过带三辛EDTA和PBS的细胞。

根据手稿说明，准备新鲜的 4% 甲醛、培养基和 1% 明胶溶液。然后用70%乙醇清洁层流罩，并放置所有必需的材料。甲醛是极其危险的。

必须时刻佩戴适当的 PPE，并且只能在化学罩中处理。将所需的细胞生长到70%汇合后，将它们从培养箱中取出，并放在层流罩中。取出培养介质，用 PBS 冲洗细胞两次。

在培养瓶中加入约两毫升0.25%的三丁辛EDTA，并在37摄氏度下孵育5分钟。定期在倒置显微镜上检查细胞，以监测分离。当细胞分离时，在10毫升培养培养中轻轻重新悬浮，小心移液，形成单个细胞悬浮液。

将电池悬浮液转移到50毫升锥形管中，并在200次G'下离心5分钟。去上一液，然后加入10毫升的培养介质，轻轻重新暂停颗粒。服用20微升的细胞悬浮液，并混合与尝试蓝在一对一的体积比。

然后使用标准血细胞切除术计算细胞。将盖滑放在六井板的每个井内，用明胶溶液的两毫升涂覆滑，这将有助于附着在盖板上的细胞。取出明胶，让板风干几分钟。

种子10万成纤维细胞进入每井，并添加两毫升的培养媒介。然后在37摄氏度、5%的二氧化碳和90%的相对湿度下孵育细胞24小时。孵育后治疗细胞诱导细胞。

将 4%的甲状甲醛加热至室温，并准备牧场移液器、ABS、废容器、15 毫升锥形管、微型移液器和尖端。从培养箱中取出细胞，放在实验室的长凳上。从每个井上拆下介质，使盖滑。

用两毫升 PBS 轻轻清洗细胞三次。然后将 4%PFA 的两毫升添加到每个井中以修复细胞。在室温下孵育板10分钟，然后取出PFA，然后用PBS重复洗涤。

在每个井中加入两毫升0.5%Triton X-100，并孵育板15分钟。然后用PBS洗四次井。要制作阻断溶液，解冻山羊血清五分钟，并在PBS中以1比20的比例稀释。

将溶液的150微升添加到每个盖滑中，并孵育板20分钟。解冻原抗体五分钟，并在PBS中单独稀释，如文本手稿中所述。从盖滑道上去除阻抗溶液，并添加两种抗体溶液的 150 微升。

然后在室温下孵育板60分钟。取出原抗体，用两毫升PBS轻轻清洗盖滑三次。在PBS中稀释Cy3绵羊抗小鼠和Alexa氟488山羊抗兔，比例为1比300，并在盖滑中加入150微升的二次抗体溶液。

在 50 毫升 PBS 中稀释 10 微升库存，并准备工作 DAPI 解决方案，并将稀释的 2 毫升添加到盖滑中。在黑暗中，在室温下孵育板5分钟。在将盖板滑在幻灯片上之前，请准备两根针、钳子和安装介质，并标记所有幻灯片。

从井中去除 DAPI 溶液，用 PBS 清洗三次。在每张幻灯片上放置一滴安装介质。使用针头轻轻地将盖滑从井底提起。

然后翻转它，轻轻地把它放在安装介质的滴使用钳子。小心地清除任何气泡。保护幻灯片免受光线影响，并在四摄氏度下过夜。

第二天，使用具有高放大率的荧光或共和显微镜来可视化原发性西莉亚。该协议用于修复免疫污，并图像各种细胞系表达原发性cilia。当小鼠肌细胞以各种剂量暴露在电离辐射下时，发现高剂量会诱发多种原发性西莉亚的出现。

而低剂量导致单一原发性西莉亚的出现。同样，当人类肺成纤维细胞以低剂量辐射时，通过免疫荧光检测到单一原发性丝细胞。在饥饿的小鼠胚胎成纤维细胞中观察到原发性丝丝的增加，这表明代谢应激影响原发性西莉亚的事故。

当皮肤成纤维细胞被120纳米摩尔多索鲁比辛治疗时，它们表示一个单一原发性柠檬。高剂量诱导多个原发性西莉亚的外观。用1.25纳米摩尔分类治疗的成纤维细胞也表达单一原发性。

但治疗剂量较高后未检测到多个西莉亚。打开此协议时，请务必遵守所有 PPE 法规。请记住您选择的细胞系的培养需求，并仔细选择您的抗体。

此过程不能直接遵循其他程序，因为单元格是不可恢复的。相反，应对并行实验进行编程。