このプロトコルは、様々な研究努力の中で、培養細胞内の原発繊の迅速かつ容易な検出を可能にする。この方法は、原発繊毛の基底体に影響を与える障害で利用することができる。この手順は、パラフィン埋め込み組織での原発繊毛の染色や、蛍光が必要な他の実験にも適用できます。
22 x 22ミリメートルのカバースリップをオートクレーブし、実験用の材料を準備します。FBSおよびペニシリンストレプトマイシンを解凍し、培養培地を室温に温める。トリプシンEDTAおよびPBSで細胞を通過させる。
原稿の指示に従って、新鮮な4%パラホルムアルデヒド、培養培地、および1%ゼラチン溶液を調製する。その後、70%エタノールで層流フードを洗浄し、すべての必要な材料を内部に入れます。パラホルムアルデヒドは非常に危険です。
適切なPPEは常に着用する必要があり、それは化学フードでのみ処理する必要があります。所望の細胞を70%合流に成長した後、インキュベーターからそれらを取り除き、層流フードに入れます。培養液を取り出し、PBSで細胞を2回リンスします。
培養フラスコに0.25%トリプシンEDTAの約2ミリリットルを加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。反転顕微鏡で細胞を定期的にチェックして、剥離を監視します。細胞が10ミリリットルの培養培地で穏やかに再懸濁した場合、慎重にピペット処理して単一の細胞懸濁液を作り出す。
細胞懸濁液を50ミリリットル円錐形チューブに移し、200倍G'5分間遠心分離します。上清をデカントし、10ミリリットルの培養培地を加え、ペレットを軽く再懸濁します。細胞懸濁液を20マイクロリットル取り、1対1の体積比でトリパンブルーと混ぜます。
次に、標準的なヘモサイトメトリーを使用して細胞を数えます。6つのウェルプレートの各ウェルの中にカバースリップを置き、カバースリップに2ミリリットルのゼラチン溶液をコーティングします。ゼラチンを取り出し、プレートを数分間空気乾燥させます。
種子100,000の線維芽細胞を各ウェルに入れ、2ミリリットルの培養培地を添加する。その後、セルを摂氏37度、二酸化炭素5%、相対湿度90%で24時間インキュベートします。培養後、毛様体化を誘導するために細胞を治療する。
4%パラホルムアルデヒドを室温まで温め、牧草地のピペット、ABS、廃容器、15ミリリットルの円錐管、マイクロピペット、および先端を準備します。インキュベーターから細胞を取り出し、ラボベンチに置きます。カバースリップを残して、各井戸からメディアを取り外します。
2ミリリットルのPBSで細胞を3回軽く洗います。その後、細胞を固定するために各ウェルに4%PFAの2ミリリットルを追加します。プレートを室温で10分間インキュベートし、PFAを取り出し、PBSで洗い洗いを繰り返します。
各ウェルに0.5%トリトンX-100の2ミリリットルを加え、プレートを15分間インキュベートします。その後、PBSで井戸を4回洗います。ブロッキング溶液を作るために、ヤギの血清を5分間解凍し、PBSで1〜20の比率で希釈します。
各カバースリップにこの溶液の150マイクロリットルを加え、20分間プレートをインキュベートします。一次抗体を5分間解凍し、テキスト原稿に記載されているようにPBSで別々に希釈する。カバースリップからブロッキング溶液を取り除き、両方の抗体溶液の150マイクロリットルを加えます。
その後、プレートを室温で60分間インキュベートします。一次抗体を取り除き、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回軽く洗います。希釈Cy3羊抗マウスとアレクサフルーター488ヤギ抗ウサギをPBSで1〜300の比率で、カバースリップに両方の二次抗体溶液の150マイクロリットルを追加します。
50ミリリットルのPBSで10マイクロリットルのストックを希釈して作業DAPI溶液を調製し、この希釈液をカバースリップに2ミリリットル加えます。室温で、暗闇の中で5分間プレートをインキュベートします。スライドにカバースリップを配置する前に、2本の針、ピンセット、取り付けメディアを準備し、すべてのスライドにラベルを付けます。
ウェルからDAPI溶液を取り出し、PBSで3回洗浄します。各スライドに取り付けメディアを1滴置きます。針を使って、カバースリップをウェルの底からそっと持ち上げます。
その後、それを反転し、ピンセットを使用して取り付けメディアのドロップの上にそっと置きます。気泡を慎重に取り除きます。スライドを光から保護し、摂氏4度で一晩保管してください。
翌日には蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、高倍率で一次繊毛を可視化します。このプロトコルは、免疫染色体を固定するために使用され、一次繊毛を発現する様々な細胞株を画像化した。マウス筋芽細胞が様々な線量で電離放射線にさらされたとき、高用量が複数の一次繊毛の出現を誘発することを発見した。
低用量では、単一の一次繊毛の出現をもたらした.同様に、ヒト肺線維芽細胞を低用量で放射した場合、単一の原発繊毛は免疫蛍光によって検出された。飢えたマウス胚性線維芽細胞では原発繊の増加が観察され、代謝ストレスが原発性繊毛の事件に影響を及ぼすことが示された。
皮膚線維芽細胞を120ナノモルドキソルビシンで処理したところ、単一の一次シリウムを発現した。高用量は、複数の一次繊毛の出現を誘発する。1.25ナノモルタキソールで処理された線維芽細胞も単一の一次シリウムを発現した。
しかし、高用量で治療した後、複数の繊毛は検出されなかった。このプロトコルを開く際は、すべてのPPE規制に従ってください。選択した細胞ラインの培養ニーズを念頭に置き、抗体を慎重に選択してください。
細胞は取り返しのつかないため、この手順を他の手順で直接実行することはできません。代わりに、並列実験をプログラムする必要があります。
