이 프로토콜은 다양한 연구 노력 내에서 배양 된 세포에서 1 차 적인 섬모를 빠르고 쉽게 감지 할 수 있습니다. 방법은 1 차적인 섬모의 기초 바디에 영향을 미치는 무질서에서 이용될 수 있었습니다. 이 절차는 또한 파라핀 임베디드 조직에서 1 차적인 섬모를 염색하거나 형광이 필요한 그밖 실험을 위해 적용될 수 있습니다.
22~22mm 커버 슬립을 오토클레이핑하고 실험을 위한 재료를 준비한다. FBS와 페니실린 연쇄 절제술을 해, 그리고 문체 매체를 실온으로 따뜻하게 합니다. 트립신 EDTA 및 PBS로 세포를 통과합니다.
원고 의 방향에 따라 신선한 4 % 파라 포름 알데히드, 문화 매체 및 1 % 젤라틴 솔루션을 준비하십시오. 그런 다음 70 %에탄올로 라미나르 흐름 후드를 청소하고 필요한 모든 재료를 내부에 놓습니다. 파라포름알데히드는 매우 위험합니다.
적절한 PPE는 항상 착용해야하며 화학 적 후드에서만 처리해야합니다. 원하는 세포를 70%로 성장한 후 인큐베이터에서 분리하여 라미나르 플로우 후드에 놓습니다. 배양 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 헹구는 다.
배양 플라스크에 0.25%의 트립신 EDTA의 약 2밀리리터를 추가하고 5분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 분리를 모니터링하기 위해 반전 된 현미경에서 세포를 주기적으로 확인하십시오. 세포가 분리되면 배양 배지의 10 밀리리터에서 부드럽게 다시 중단하여 단일 셀 서스펜션을 만들기 위해 조심스럽게 파이펫팅합니다.
셀 서스펜션을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 200배 G'로 옮긴다. 상류제를 데칭한 다음 10 밀리리터의 배양 배지를 추가하고 펠릿을 부드럽게 재보냅니다. 셀 서스펜션의 마이크로리터 20개를 사용하여 일대일 볼륨 비율로 트라이팬 블루와 혼합하십시오.
그런 다음 표준 혈중계를 사용하여 세포를 계산합니다. 6개의 웰 플레이트의 각 웰 안에 커버 슬립을 놓고 커버 슬립을 젤라틴 용액의 2밀리리터로 코팅하여 커버 슬립에 부착된 세포가 미끄러지는 데 도움이 됩니다. 젤라틴을 제거하고 접시가 몇 분 동안 공기 건조하게하십시오.
씨앗 100, 000 각 우물에 섬유 아세포와 배양 배지의 두 밀리리터를 추가. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 상대 습도 90%로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 세포를 치료하여 섬광을 유도한다.
4%의 파라포름알데히드를 실온으로 데우고 목초지 파이펫, ABS, 폐기물 용기, 15밀리리터 원판 튜브, 마이크로 파이펫 및 팁을 준비합니다. 인큐베이터에서 세포를 가져 와서 실험실 벤치에 놓습니다. 각 우물에서 미디어를 제거하고 덮개가 미끄러져 둡깁니다.
PBS의 두 밀리리터로 셀을 세 번 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 세포를 고치기 위해 각 웰에 4 %PFA의 2 밀리리터를 추가합니다. 상온에서 10분 동안 플레이트를 배양한 다음 PFA를 제거하고 PBS로 세척을 반복합니다.
각 웰에 0.5%트리톤 X-100의 밀리리터 2개를 넣고 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 PBS로 우물을 네 번 씻으시면 됩니다. 차단 용액을 만들려면 염소 세럼을 5분 동안 해동하고 PBS에서 1 대 20 비율로 희석합니다.
이 솔루션의 마이크로리터 150개를 각 커버 슬립에 넣고 플레이트를 20분 동안 배양합니다. 1차 항체를 5분 동안 해동하고, 텍스트 원고에 설명된 대로 PBS에서 별도로 희석한다. 커버 슬립에서 차단 용액을 제거하고 두 항체 용액의 150 마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 상온에서 60 분 동안 접시를 배양하십시오. 1차 항체를 제거하고 PBS의 2밀리리터로 커버 슬립을 세 번 부드럽게 씻습니다. CY3 양 항마우스 및 알렉사 플루오 488 염소 안티 토끼PBS에서 1 ~ 300 비율로 희석하고, 커버 슬립에 두 이차 항체 용액의 150 마이크로 리터를 추가합니다.
PBS의 50 밀리리터에 10 마이크로리터를 희석하여 작동하는 DAPI 솔루션을 준비하고 이 희석제 2밀리리터를 커버 슬립에 추가합니다. 상온에서 어둠 속에서 5분 동안 접시를 배양합니다. 커버를 슬라이드에 놓기 전에 두 개의 바늘, 핀셋 및 장착 미디어를 준비하고 모든 슬라이드에 레이블을 지정합니다.
우물에서 DAPI 용액을 제거하고 PBS로 세 번 세척합니다. 각 슬라이드에 마운팅 미디어를 한 방울 만 넣습니다. 바늘을 사용하여 우물 바닥에서 커버 슬립을 부드럽게 들어 올립니다.
그런 다음 그것을 뒤집어 핀셋을 사용하여 장착 매체의 드롭 위에 부드럽게 놓습니다. 조심스럽게 거품을 제거합니다. 슬라이드를 빛으로부터 보호하고 섭씨 4도에서 밤새 보관하십시오.
다음 날에는 높은 배율로 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 1 차 적인 섬모를 시각화합니다. 이 프로토콜은 면역스테인을 고치고, 1차 섬모를 발현하는 다양한 세포주를 이미지화하는 데 사용되었다. 마우스 근세포가 다양한 용량에서 이온화 방사선에 노출되었을 때, 더 높은 용량이 다중 1차 섬모의 출현을 유도하는 것으로 나타났다.
낮은 복용량 단일 기본 섬모의 출현 귀 착되 게 하는 동안. 유사하게, 인간 폐 섬유아세포가 저용량으로 방사되었을 때, 단일 1차 섬모는 면역형광에 의해 검출되었다. 1 차적인 섬모에 있는 증가는 신진 대사 스트레스가 1 차적인 섬모의 사건에 영향을 미친다는 것을 보여주는 굶주린 마우스 배아 섬유아세포에서 관찰되었습니다.
피부 섬유아세포가 120 나노몰러 독소루비신으로 치료되었을 때, 그들은 단일 1 차실을 표현했다. 더 높은 복용량 여러 기본 섬모의 모양을 유도. 1.25 나노 몰라 탁솔로 치료 된 섬유 아세포도 단일 기본 실륨을 표현했다.
그러나 다중 섬모는 더 높은 복용량으로 처리 후에 검출되지 않았습니다. 이 프로토콜을 열 때 모든 PPE 규정을 따라야 합니다. 선택의 세포주의 배양 요구를 명심하고 신중하게 항체를 선택하십시오.
이 절차는 세포가 복구할 수 없기 때문에 다른 절차를 직접 따를 수 없습니다. 대신 병렬 실험을 프로그래밍해야 합니다.
