Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und einfache Erkennung von primären Zilien in kultivierten Zellen, innerhalb einer Vielzahl von Forschungsbemühungen. Die Methode könnte bei Unordnung verwendet werden, die die Basalkörper der primären Zilien beeinflussen. Dieses Verfahren kann auch zur Färbung der primären Zililia im paraffineingebetteten Gewebe oder für andere Experimente angewendet werden, bei denen Fluoreszenz erforderlich ist.
Beginnen Sie mit dem Autoklavieren von 22 mal 22 Millimetern Deckschscheinen und der Vorbereitung von Materialien für das Experiment. FBS und Penicillin Streptomycin auftauen und das Kulturmedium auf Raumtemperatur erwärmen. Durchfahrt der Zellen mit Trypsin EDTA und PBS.
Bereiten Sie frische 4%Paraformaldehyd, Kulturmedium und 1%Gelatinelösung nach Manuskriptrichtungen vor. Reinigen Sie dann die laminare Durchflusshaube mit 70% Ethanol und platzieren Sie alle benötigten Materialien darin. Paraformaldehyd ist extrem gefährlich.
Richtige PSA muss zu jeder Zeit getragen werden, und es sollte nur in einer chemischen Haube behandelt werden. Nach dem Wachstum der gewünschten Zellen auf 70%Konfluss entfernen Sie sie aus dem Inkubator und legen Sie sie in die laminare Strömungshaube. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
Fügen Sie etwa zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA in den Kulturkolben und inkubieren Sie ihn bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig auf dem invertierten Mikroskop, um die Ablösung zu überwachen. Wenn die Zellen sich gelöst haben, halten Sie sie vorsichtig in 10 Milliliter Kulturmedium ab, und pipetieren Sorgfältig, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr und zentrieren Sie sie bei 200 mal G'für fünf Minuten. Dekantieren Sie den Überstand dann fügen Sie 10 Milliliter Kulturmedium, und sanft das Pellet wieder aufhängen. Nehmen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie sie mit Trypan blau im Verhältnis zu einem Volumen.
Zählen Sie dann die Zellen mit der Standardhäozytometrie. Legen Sie einen Deckelschlupf in jeden Brunnen einer sechs Brunnenplatte, und beschichten Sie den Deckelschlupf mit zwei Milliliter der Gelatinelösung, die den Zellen, die an der Abdeckung befestigt sind, helfen, zu rutschen. Entfernen Sie die Gelatine und lassen Sie die Platte für ein paar Minuten lufttrocknen.
Samen 100. 000 Fibroblasten in jedem Brunnen und fügen Sie zwei Milliliter Kulturmedium. Dann inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid und 90% relative Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation behandeln Sie die Zellen, um Dieziation zu induzieren.
Erwärmen Sie das 4%paraformaleDehyd auf Raumtemperatur und bereiten Sie eine Weidepipetten, ABS, einen Abfallbehälter, 15 Milliliter konische Rohre, Mikropipetten und Spitzen vor. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und legen Sie sie auf die Laborbank. Entfernen Sie die Medien von jedem Brunnen, so dass der Deckel schlupf.
Waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS dreimal. Fügen Sie dann zwei Milliliter der 4%PFA in jeden Brunnen hinzu, um die Zellen zu fixieren. Inkubieren Sie die Platte für 10 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann die PFA, und wiederholen Sie die Waschungen mit PBS.
Fügen Sie zwei Milliliter 0,5%Triton X-100 zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte für 15 Minuten. Dann waschen Sie die Brunnen viermal mit PBS. Um die Blockierlösung zu machen, tauen Sie ein Ziegenserum für fünf Minuten auf und verdünnen Sie es in PBS im Verhältnis eins bis 20.
Fügen Sie 150 Mikroliter dieser Lösung zu jedem Deckschlupf hinzu und inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten. Die primären Antikörper fünf Minuten lang auftauen und separat in PBS verdünnen, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie die Blockierlösung aus den Abdeckzetteln und fügen Sie 150 Mikroliter beider Antikörperlösungen hinzu.
Dann inkubieren Sie die Platte für 60 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie die Abdeckungsrutschen mit zwei MilliliterPBS dreimal. Verdünnen Sie Cy3 Sheep Anti-Mouse und Alexa fluor 488 Goat Anti-Rabbit in PBS, im Verhältnis eins bis 300, und fügen Sie 150 Mikroliter der beiden sekundären Antikörperlösungen in den Deckelschlupf.
Bereiten Sie eine funktionierende DAPI-Lösung vor, indem Sie 10 Mikroliter des Lagerbestands in 50 Milliliter PBS verdünnen und zwei Milliliter dieser Verdünnung zu den Abdeckzetteln hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für fünf Minuten im Dunkeln, bei Raumtemperatur. Bevor Sie die Deckelscheine auf die Folien legen, bereiten Sie zwei Nadeln, eine Pinzette und Einbaumedien vor, und beschriften Sie alle Folien.
Entfernen Sie die DAPI-Lösung aus den Brunnen, und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Legen Sie einen Tropfen Montagemedien auf jede Folie. Verwenden Sie die Nadel, um den Deckelrutsch vorsichtig vom Boden des Brunnens zu heben.
Dann kippen Sie es und legen Sie es vorsichtig über den Tropfen der Montagemedien mit der Pinzette. Entfernen Sie vorsichtig alle Blasen. Schützen Sie die Dias vor Licht und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Tag verwenden Sie ein fluoreszierendes oder konfokales Mikroskop mit hoher Vergrößerung, um die primäre Zilien zu visualisieren. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Immunostain zu fixieren und verschiedene Zelllinien abzubilden, die primäre Zilien exdrücken. Wenn Maus-Myoblasten ionisierender Strahlung in verschiedenen Dosen ausgesetzt waren, wurde festgestellt, dass höhere Dosen das Auftreten mehrerer primärer Zilien induzieren.
Während niedrige Dosen führten zum Auftreten von einzelnen primären Zilien. In ähnlicher Weise wurden bei der Abstrahlung menschlicher Lungenfibroblasten in niedriger Dosis einzelne primäre Zilien durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Eine Zunahme der primären Zilien wurde bei mausembryonalen Fibroblasten beobachtet, die verhungert waren, was zeigt, dass metabolischer Stress die Vorfälle der primären Zilien beeinflusst.
Wenn Hautfibroblasten mit 120 nanomolaren Doxorubicin behandelt wurden, drückten sie ein einziges primäres Cilium aus. Höhere Dosen induzieren das Auftreten von mehreren primären Zilien. Fibroblasten, die mit 1,25 Nanomolar Taxol behandelt wurden, exprimierten auch ein einziges primäres Cilium.
Aber mehrere Zilien wurden nach der Behandlung mit höheren Dosen nicht nachgewiesen. Achten Sie beim Öffnen dieses Protokolls darauf, dass sie alle PSA-Vorschriften befolgen. Denken Sie an die Kulturbedürfnisse Ihrer Zelllinie Ihrer Wahl und wählen Sie Ihre Antikörper sorgfältig aus.
Diesem Verfahren können nicht direkt andere Verfahren folgen, da die Zellen unwiederbringlich sind. Stattdessen sollten parallele Experimente programmiert werden.
