זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מהיר וקל של הוסים ראשוניים בתאים מתורבתים, במגוון מאמצי מחקר. השיטה יכולה להיות מנוצלת בהפרעה המשפיעה על הגופים הבסיסיים של cilia העיקרי. הליך זה יכול להיות מיושם גם על הכתמת cilia ראשוני ברקמה מוטבעת פרפין או עבור ניסויים אחרים שבהם יש צורך פלואורסצנטיות.

התחל על ידי autoclaving 22 על ידי 22 מילימטר כיסוי מחליק, והכנת חומרים לניסוי. להפשיר FBS וסטרפטומיצין פניצילין, לחמם את התרבות בינוני לטמפרטורת החדר. מעבר התאים עם טריפסין EDTA ו PBS.

הכינו פתרון טרי של 4% פרפורמלדהיד, מדיום תרבותי ו-1% ג'לטין, לפי הוראות כתב היד. לאחר מכן נקו את מכסה המנוע לזרימת למינאר עם 70% אתנול, והניחו את כל החומרים הדרושים בפנים. פרפורמלדהיד מסוכן ביותר.

PPE הנכון צריך להיות משוחק בכל עת, וזה צריך להיות מטופל רק ברדס כימי. לאחר גידול התאים הרצויים ל 70% confluence להסיר אותם מן החממה, ולמקום אותם מכסה המנוע לזרימה למינארית. הסר את מדיום התרבות ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.

מוסיפים כשני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לבקבוק התרבות, ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בדוק את התאים מעת לעת במיקרוסקופ ההפוך כדי לפקח על הניתוק. כאשר התאים התנתקו בעדינות resuspend אותם 10 מיליליטר של מדיום תרבות, צינורות בזהירות כדי ליצור השעיה תא יחיד.

העבר את ההשעיה התא לצינור חרוט 50 מיליליטר וצנטריפוגה אותו ב 200 פעמים G'for חמש דקות. Decant העל-טבעי ואז להוסיף 10 מיליליטר של תרבות בינונית, בעדינות resuspend את גלולה. קח 20 microliters של המתלה התא ומערבבים אותו עם כחול trypan ביחס נפח של אחד לאחד.

ואז לספור את התאים באמצעות hemocytometry סטנדרטי. מניחים להחליק כיסוי בתוך כל באר של צלחת שש היטב, ולכסות את החלקת הכיסוי עם שני מיליליטר של תסמעיל ג'לטין, אשר יסייע לתאים המחוברים להחליק את הכיסוי. מוציאים את הג'לטין ותנו לצלחת להתייבש באוויר לכמה דקות.

זרעים 100, 000 fibroblasts לתוך כל באר ולהוסיף שני מיליליטר של תרבות בינונית. לאחר מכן הדגירה את התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני, ו 90% לחות יחסית. לאחר הדגירה לטפל בתאים כדי לגרום ciliation.

מחממים את הפרפורמלדהיד 4% לטמפרטורת החדר, ומכינים פיפטיות מרעה, ABS, מיכל פסולת, צינורות חרוטיים 15 מיליליטר, מיקרו פיפטים וטיפים. קח את התאים מהאינקובטור, והצב אותם על ספסל המעבדה. הסר מדיה מכל באר, והשאיר את פתק הכיסוי.

בעדינות לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של 4%PFA לתוך כל באר כדי לתקן את התאים. הדגירה את הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את PFA, ולחזור על לשטוף עם PBS.

מוסיפים שני מיליליטר של 0.5% טריטון X-100 לכל באר, ו דגירה את הצלחת במשך 15 דקות. ואז לשטוף את בארות ארבע פעמים עם PBS. כדי להפוך את פתרון החסימה, להפשיר סרום עז במשך חמש דקות, ולדלל אותו PBS ביחס של 1 עד 20.

הוסיפו 150 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל תלוש כיסוי, והם דגירה של הצלחת במשך 20 דקות. להפשיר את הנוגדנים העיקריים במשך חמש דקות, ולדלל אותם בנפרד PBS, כמתואר בכתב היד טקסט. הסר את פתרון החסימה מתלי הכיסוי והוסף 150 מיקרוליטרים של שני פתרונות הנוגדנים.

ואז לה הדגירה את הצלחת במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הנוגדנים העיקריים בעדינות לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לדלל Cy3 כבשים נגד עכבר ו פלואור אלקסה 488 עז נגד ארנב ב PBS, ביחס של אחד עד 300, ולהוסיף 150 microliters של שני פתרונות נוגדנים משניים להחליק את הכיסוי.

הכן פתרון DAPI עובד על ידי דילול 10 microliters של המניה ב 50 מיליליטר של PBS, ולהוסיף שני מיליליטר של דילול זה לתעודות הכיסוי. דגירה הצלחת במשך חמש דקות בחושך, בטמפרטורת החדר. לפני הנחת החלקות הכיסוי על השקופיות, הכן שני מחטים, פינצטה ומדיית הרכבה ותייג את כל השקופיות.

הסר את פתרון DAPI מן בארות, ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. שים טיפה אחת של מדיית טעינה בכל שקופית. השתמש במחט כדי להרים בעדינות את החלקת המכסה מתחתית באר.

ואז להפוך אותו בעדינות למקם אותו על טיפת מדיה הרכבה באמצעות פינצטה. בזהירות להסיר את כל הבועות. הגן על המגלשות מפני אור ואחסן אותן במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי עם הגדלה גבוהה כדי לדמיין את הוסטליה העיקרית. פרוטוקול זה שימש לתיקון כשל חיסוני, ולתדמית קווי תאים שונים המבטלים דימויים ראשוניים. כאשר myoblasts העכבר נחשפו קרינה מייננת במינונים שונים, נמצא כי מינונים גבוהים יותר לגרום את המראה של מספר רב של cilia ראשוני.

בעוד מינונים נמוכים גרמו המראה של cilia ראשוני יחיד. באופן דומה, כאשר פיברובלסטים ריאות אנושיים הקרינו במינון נמוך, cilia ראשוני יחיד זוהו על ידי immunofluorescence. עלייה ב- cilia העיקרי נצפתה פיברובלסטים עובריים עכבר כי היו מורעבים, הוכחת כי מתח מטבולי משפיע על האירועים של cilia העיקרי.

כאשר פיברובלסטים בעור טופלו עם 120 טוקסורובין ננו-מולארי, הם הביעו סיליום ראשוני יחיד. מינונים גבוהים יותר לגרום את המראה של שכבות ראשוניות מרובות. פיברובלסטים שטופלו ב-1.25 ננומולרים מטילול גם הביעו סיליום ראשוני יחיד.

אבל פעמים רבות לא זוהו לאחר הטיפול במינונים גבוהים יותר. בעת פתיחת פרוטוקול זה הקפד לפעול בהתאם לכל תקנות PPE. זכור את צרכי התרבות של קו התאים שלך של בחירה ובחר את הנוגדנים שלך בזהירות.

הליך זה לא יכול להיות מלווה ישירות על ידי הליכים אחרים, שכן התאים הם בלתי הפיך. במקום זאת, יש לתכנת ניסויים מקבילים.