该协议允许使用荧光显微镜直接成像幼鼠或成年小鼠骨髓轴子中神经丝质群，因此可以测量分离神经段中神经丝状传输的方向性和速度。这种方法取决于小鼠是否可表达感兴趣的蛋白质的光激活荧光融合，但可以适用于任何容易解剖的神经。首先，将含氧盐水倒入 60 毫升注射器中，并确保注射器中剩余的空气最少。
将注射器连接到管子，然后将流出管放入废瓶中。将外垫片放入灌注室壳体中，确保进气口和出口柱与垫片上的孔对齐，然后将内垫片放在编号 1.5 圆形盖玻片上，并小心地平滑垫片中的任何皱纹，以确保密封紧密。将盖玻片和垫片放在纸巾上，或将垫片朝上擦拭任务。
使用一双大型解剖剪刀在靠近脊柱中间的皮肤做一个后切，并继续在动物的腹边周围切开。慢慢地把皮肤从肌肉上拉开，切开筋膜。接下来，使用微切除剪刀在大腿肌肉的尾巴和膝盖中间切口，以暴露坐骨神经。
确保通过肌肉可见的神经不会被切割。将切口伸向伤口和内向，以去除肌肉，然后切除小腿的肌肉，保持切口浅和短，以避免损害神经。继续切除肌肉，直到双骨神经完全暴露在从坐骨神经分支到脚跟的点。
用一双钳子抓住脊柱近端的尖刺神经，用一把微切除剪刀剪断，确保不要对神经施加太大的张力。小心地把它从肌肉上抬起来，切开任何附件，注意不要使神经紧张。切开脊柱端端的三口神经，并转移到一个小的培养皿室温氧盐。
从神经的近端开始，轻轻抓住暴露的斧头末端，用一对非常精细的尖端钳子。用第二对钳子，紧扣神经护套，慢慢拉向神经的端端，确保在这个过程中不会施加不必要的张力。抓住神经的近端，慢慢地放下它到盖玻片上，然后在柔和的张力下拉直它。
将微槽滑轨滑过神经，向下凹槽滑动，将流的方向与神经平行。翻转盖玻片和微灌管组件，将其放在灌注室壳体中，滑动器与外垫片相反。要固定多体室，请将其放在金属壳体中并旋转锁环。
慢慢压抑盐水注射器柱塞，并充满灌注室。在设置和成像过程中，请时刻将进气管、出口瓶和注射器保持高于腔室本身。将灌注组件转移到倒置显微镜阶段，将盐水注射器安装到注射器泵中，然后启动电机并调整速度，速度为每分钟 0.25 毫升。
连接内联解决方案加热器，将其设置为 37 摄氏度。连接目标加热器并设置为 37 摄氏度。将机油涂抹到目标上，并将灌注室插入舞台支座。
将机油涂抹到腔室加热器垫上，并将其连接到灌注室，然后将其连接并设置为 37 摄氏度。将灌注室锁定到舞台适配器中，并将目标机油与腔室底面的盖玻片接触。使用 Brightfield 照明将焦点放在最接近盖玻片表面的神经底部表面的轴孔层上。
骨髓轴子可以通过在亮场透光照明下可见的骨髓护套来识别，无需对比度增强。获取 Brightfield 参考图像，记录神经的方向性，然后使用 488 纳米激光和适用于光激活 GFP 的发射滤波器获取共和图像。将激光功率设置为正常成像功率的大约五倍，获取曝光时间为三到四分钟的图像，然后获取另一个共声图像，以记录漂白步骤后激活前的自动荧光。
绘制一条平行于轴线的线，其长度等于 Brightfield 图像所需的激活窗口大小。使用此线作为参考，在垂直于轴的视场中绘制一个矩形感兴趣区域。使用 405 纳米光通过模式激发激活该区域中的 GFP 荧光，确保在激活之前和激活后立即获取图像。
激活完成后，启动一分钟计时器。当它启动时，开始获取延时系列。将250毫克荧光素粉加入0.5毫升双蒸馏水中，混合至无可见颗粒，然后在桌面离心机中旋转溶液30秒，沉淀任何未溶解的材料。
在幻灯片中添加八升荧光素溶液，并应用数字 1.5 盖玻片。将多余的液体擦干，用指甲油密封盖玻片，让滑梯变干。将滑动盖玻片侧向下放在倒置显微镜阶段，并调整覆盖玻片表面荧光薄平面的焦点。
移动幻灯片以查找不包含气泡或大荧光素颗粒的视场，并获取以 0.2 微米间隔跨越 6 微米的 Z 堆栈，使中间图像成为原始对焦平面。关闭所有光路快门，包括相机快门，将激光功率和曝光时间设置为零秒。使用这些设置获取 100 个图像的堆栈，这些设置将平均生成暗场图像。
此处显示了脉冲逃逸和脉冲传播实验中的代表性图像。对于脉冲逃逸方法，激活区域的荧光衰减动力学可以产生长期和短期暂停行为的信息。激活区域可以是这些实验的短区。
脉冲传播方法使用更长的激活区域，以提供更大的荧光神经丝池。这延长了侧翼区域荧光增加保持线性的时间。此处使用 15 微米侧翼窗口。
测量窗口的总荧光被量化。衰减对于脉冲逃逸方法是双相数的，初始指数衰减表示轨道神经丝的离开，第二个较慢的指数衰减在 10 到 20 分钟内表示偏离轨道的灯丝的偏离。对于脉冲扩散策略，运动的速度和方向的计算仅取决于侧翼窗口中的坡度。
对于此处使用的窗口长度，线性相位将延长约五分钟。此处显示了糖基抑制神经的延时，表明从激活区域的传输明显减少。事实上，在用抑制剂治疗的神经中，近边和近边斜率明显较低。
这两个条件之间的人口速度也显著下降。尝试此协议时，请记住，在动物牺牲后神经健康下降时，仓促进行解剖和室组装部分至关重要。神经元细胞培养允许测量和分析单个神经丝的运动，这将补充使用该协议收集的人口规模数据。
