Este protocolo permite a imagem direta da população de neurofilamento em axônios mieliados de camundongos juvenis ou adultos usando microscopia de fluorescência, possibilitando medir a direcionalidade e a velocidade do transporte de neurofilamento em segmentos nervosos isolados. Este método depende da disponibilidade de camundongos expressando uma fusão fluorescente fotoativa da proteína de interesse, mas pode ser adaptado para uso em qualquer nervo prontamente dissecado. Para começar, despeje soro fisiológico oxigenado em uma seringa de 60 mililitros e certifique-se de que há ar mínimo restante na seringa.
Conecte a seringa à tubulação e coloque o tubo de saída em um frasco de resíduos. Coloque a junta externa na carcaça da câmara de perfusão, garantindo que a entrada de fluxo e os postes de saída estejam alinhados com os orifícios da junta, em seguida, coloque a junta interna em uma tampa circular número 1,5 e suavize cuidadosamente quaisquer rugas na junta para garantir uma vedação apertada. Coloque a tampa e a junta em uma toalha de papel ou uma limpeza de tarefa com a junta voltada para cima.
Use um par de tesouras de dissecção grande para fazer uma incisão dorsal na pele perto do meio da coluna vertebral e continue a cortar em torno do aspecto ventral do animal. Puxe lentamente a pele para longe do músculo e corte a fáscia. Em seguida, use uma tesoura de microdisseção para fazer uma incisão nos músculos da coxa no meio do caminho entre a cauda e o joelho para expor o nervo ciático.
Certifique-se de que o nervo, que é visível através do músculo, não seja cortado. Estique a incisão dorsal e ventrally para remover o músculo, em seguida, remova os músculos da panturrilha, mantendo os cortes rasos e curtos para evitar danificar os nervos. Continue removendo os músculos até que o nervo tibial esteja totalmente exposto do ponto onde ele se ramifica do nervo ciático até o calcanhar.
Segure o nervo tibial na extremidade proximal da coluna vertebral com um par de fórceps e corte-o com um par de tesouras de microdisseção, certificando-se de não aplicar muita tensão ao nervo. Levante-o cuidadosamente do músculo e corte qualquer apego, tomando cuidado para não colocar tensão no nervo. Corte a extremidade distal da coluna vertebral do nervo tibial e transfira-a para uma pequena placa de Petri de soro fisiológico oxigenado à temperatura ambiente.
A partir da extremidade proximal do nervo, segure suavemente as extremidades do axônio exposto com um par de fórceps de ponta muito finos. Com um segundo par de fórceps, segure a bainha nervosa proximalmente e puxe lentamente para a extremidade distal do nervo certificando-se de que nenhuma tensão indevida seja aplicada durante este processo. Segure a extremidade proximal do nervo e lentamente deite-a em uma mancha de cobertura, em seguida, endireitar-lo sob tensão suave.
Coloque o deslizamento do microacoduto sobre o nervo com o deslizamento ranhurado para baixo e posicione a direção do fluxo paralelo ao nervo. Vire o deslizamento de tampas e o conjunto de micropacdutos e coloque-o na caixa da câmara de perfusão com o slide oposto à junta externa. Para fixar a câmara de profusão, coloque-a na caixa metálica e gire o anel de bloqueio.
Deprimir lentamente o êmbolo da seringa salina e encher a câmara de perfusão. Mantenha a entrada e a saída de tubos, o frasco de saída e a seringa elevados acima da própria câmara o tempo todo durante a configuração e a imagem. Transfira o conjunto de profusão para um estágio de microscópio invertido e monte a seringa salina na bomba de seringa, em seguida, inicie o motor e ajuste a velocidade para uma taxa de fluxo de 0,25 mililitros por minuto.
Conecte o aquecedor de solução inline e coloque-o a 37 graus Celsius. Conecte o aquecedor objetivo e coloque-o a 37 graus Celsius. Aplique óleo ao objetivo e insira a câmara de profusão na montagem do palco.
Aplique óleo na almofada de aquecedor da câmara e conecte-o à câmara de perfusão, em seguida, conecte-o e coloque-o a 37 graus Celsius. Tranque a câmara de profusão no adaptador de palco e leve o óleo objetivo para contato com o deslizamento de cobertura na parte inferior da câmara. Use a iluminação Brightfield para se concentrar na camada de axônios na superfície inferior do nervo mais próximo da superfície da mancha.
Axônios mielinados podem ser identificados pela presença de uma baia de mielina que é visível sob iluminação de luz transmitida brightfield sem aprimoramento de contraste. Adquira uma imagem de referência Brightfield, registrando a direcionalidade do nervo, em seguida, adquira uma imagem confocal usando um laser de 488 nanômetros e um filtro de emissão apropriado para GFP fotoativatável. Defina a potência laser para aproximadamente cinco vezes a potência normal de imagem e adquira uma imagem com um tempo de exposição de três a quatro minutos, em seguida, adquira outra imagem confocal para registrar a autofluorescência pré-ativação após a etapa de branqueamento.
Desenhe uma linha paralela aos axônios com um comprimento igual ao tamanho da janela de ativação desejada da imagem Brightfield. Usando esta linha como guia, desenhe uma região retangular de interesse através do campo de visão perpendicular aos axônios. Ative a fluorescência GFP nesta região por excitação de padrão com a luz de 405 nanômetros, certificando-se de que uma imagem seja adquirida pouco antes e imediatamente após a ativação.
À medida que a ativação termina, inicie um temporizador de um minuto. Quando explodir, comece a aquisição de uma série timelapse. Adicione 250 miligramas de pó de fluoresceína a 0,5 mililitros de água dupla destilada e misture-a até que não haja partículas visíveis, em seguida, gire a solução por 30 segundos em uma centrífuga de mesa para sedimentar qualquer material não resolvido.
Adicione oito microliters de solução de fluoresceína a um slide e aplique um deslizamento de tampas número 1,5. Limpe o excesso de líquido, sele a tampa com esmalte e deixe o slide secar. Coloque o slide descalada lateral para baixo no estágio do microscópio invertido e ajuste o foco no plano fino de fluorescência na superfície do deslizamento.
Mova o slide ao redor para encontrar um campo de visão que não contenha bolhas de ar ou grandes partículas de fluoresceína e adquira uma pilha de Z que abrange seis micrômetros a intervalos de 0,2 micrômetros de modo que a imagem do meio seja o plano de foco original. Feche todas as persianas do caminho da luz, incluindo o obturador da câmera e ajuste a potência do laser e o tempo de exposição para zero segundos. Adquira uma pilha de 100 imagens com essas configurações, que serão mediadas para gerar a imagem de campo escuro.
Imagens representativas de experimentos de fuga de pulso e propagação de pulso são mostradas aqui. Para o método de fuga de pulso, a fluorescência decai cinética na região ativada pode produzir informações sobre comportamento de pausa a longo prazo e de curto prazo. A região ativada pode ser curta para esses experimentos.
Uma região ativada mais longa é usada para o método de propagação de pulso, a fim de fornecer uma maior piscina de neurofilamentos fluorescentes. Isso alonga o tempo sobre o qual o aumento da fluorescência nas regiões de flanqueamento permanece linear. 15 janelas de flanqueamento de micrômetros são usadas aqui.
A fluorescência total da janela de medição foi quantificada. A decadência é bifásica para o método de fuga de pulso com uma decadência exponencial inicial representando a partida de neurofilamentos na pista e uma segunda decadência exponencial mais lenta em 10 a 20 minutos que representa a partida de filamentos fora da pista. Para a estratégia de propagação de pulso, os cálculos da velocidade e direcionalidade do movimento dependem apenas das encostas nas janelas de flanqueamento.
Para os comprimentos da janela utilizados aqui, a fase linear se estende por cerca de cinco minutos. Um timelapse de um nervo glicogliticamente inibido é mostrado aqui, demonstrando uma aparente redução no transporte para fora da região ativada. De fato, as encostas distal e proximal são significativamente menores nos nervos tratados com inibidor.
Há também uma diminuição significativa da velocidade populacional entre essas duas condições. Ao tentar este protocolo, lembre-se que é crucial ser precipitado na condução das porções de dissecção e montagem da câmara à medida que a saúde nervosa diminui após o sacrifício do animal. A cultura celular neuronal pode permitir a medição e análise do movimento de neurofilamentos individuais, o que complementaria os dados da escala populacional coletados por meio desse protocolo.
