يسمح هذا البروتوكول بالتصوير المباشر للسكان العصبيين في المحاور النخاعية من الفئران اليافعة أو البالغة باستخدام المجهر الفلوري ، مما يجعل من الممكن قياس اتجاه وسرعة نقل الليفية العصبية في أجزاء عصبية معزولة. تعتمد هذه الطريقة على توافر الفئران التي تعبر عن الانصهار الفلورسنت القابل للتكييف الضوئي للبروتين الذي يهمك ، ولكن يمكن تكييفها للاستخدام في أي عصب يتم تشريحه بسهولة. للبدء، صب ملح أكسجين في حقنة 60 ملليلتر وضمان أن هناك الحد الأدنى من الهواء المتبقي في الحقنة.
توصيل الحقنة إلى أنابيب، ثم وضع أنبوب تدفق في قارورة النفايات. وضع طوقا الخارجي في السكن غرفة الضخ، وضمان أن يتم محاذاة مدخل تدفق وظائف منفذ مع الثقوب في طوقا، ثم وضع طوقا الداخلية على عدد 1.5 غطاء دائري وسلاسة بعناية أي التجاعيد في طوقا لضمان ختم ضيق. ضع غطاء الأغطية والحشاء على منشفة ورقية أو مسح مهمة مع طوقا تواجه ما يصل.
استخدام زوج من مقص تشريح كبيرة لجعل شق الظهري في الجلد بالقرب من منتصف العمود الفقري والاستمرار في قطع حول الجانب البطني للحيوان. سحب ببطء الجلد بعيدا عن العضلات وقطع اللفافة. بعد ذلك ، استخدم مقص microdissection لإجراء شق في عضلات الفخذ في منتصف الطريق بين الذيل والركبة لفضح العصب الوركي.
تأكد من أن العصب، الذي هو مرئي من خلال العضلات، لا قطع. تمديد شق الظهرية وبطينا لإزالة العضلات، ثم إزالة عضلات العجل، والحفاظ على التخفيضات الضحلة وقصيرة لتجنب الأعصاب الضارة. استمر في إزالة العضلات حتى يتعرض العصب التيبالي بشكل كامل من النقطة التي يتفرع فيها من العصب الوركي إلى الكعب.
فهم العصب الشبيبي في نهاية العمود الفقري القريب مع زوج من ملقط وقطع عليه مع زوج من مقص microdissection، مع التأكد من عدم تطبيق الكثير من التوتر على العصب. شده بعناية بعيدا عن العضلات وقطع أي مرفقات، مع الحرص على عدم وضع التوتر على العصب. قطع نهاية العمود الفقري قاصي من العصب التيبي ونقلها إلى طبق بيتري صغير من درجة حرارة الغرفة المالحة المؤكسجة.
بدءا من نهاية قريبة من العصب، فهم بلطف محور عصبي يتعرض ينتهي مع زوج من ملقط تلميح ناعم جدا. مع زوج الثاني من ملقط، فهم العصب اغدم proximally وسحب ببطء نحو نهاية الغاية من العصب التأكد من عدم وجود التوتر لا مبرر له يتم تطبيقها خلال هذه العملية. فهم الطرف القريب من العصب ووضع ببطء على غطاء، ثم تصويبه تحت توتر لطيف.
ضع الشريحة الدقيقة فوق العصب مع الانزلاق المُهزّن لأسفل ووضع اتجاه التدفق بالتوازي مع العصب. الوجه الغطاء وتجميع microaqueduct أكثر من وضعه في السكن غرفة الضخ مع الشريحة المعارضة لللقاية الخارجية. لتأمين غرفة الغزى، ضعها في السكن المعدني وتدوير حلقة القفل.
الاكتئاب ببطء المكبس حقنة المالحة وملء غرفة الضخ. الحفاظ على مدخل ومأخذ أنابيب، وقارورة منفذ، وحقنة مرتفعة فوق الغرفة نفسها في جميع الأوقات أثناء الإعداد والتصوير. نقل التجميع غزير إلى مرحلة المجهر المقلوب وتركيب حقنة الملحية في مضخة الحقنة، ثم بدء المحرك وضبط السرعة لمعدل تدفق 0.25 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.
قم بتوصيل سخان الحل المضمن وتعيينه إلى 37 درجة مئوية. ربط سخان الهدف وتعيينه إلى 37 درجة مئوية. تطبيق النفط على الهدف وإدراج غرفة الغزارة في مرحلة جبل.
تطبيق النفط على وسادة سخان الغرفة وإرفاقه إلى غرفة الضخ، ثم توصيله وتعيينه إلى 37 درجة مئوية. قفل غرفة غزير في محول المرحلة وتقديم النفط الهدف في اتصال مع غطاء على الجانب السفلي من الغرفة. استخدم إضاءة برايتفيلد للتركيز على طبقة المحاور على السطح السفلي للأعصاب الأقرب إلى سطح الغطاء.
يمكن تحديد المحاور المائلية من خلال وجود غمد المايلين الذي هو مرئي تحت إضاءة الضوء بث برايتفيلد دون تعزيز التباين. الحصول على صورة مرجعية برايتفيلد، وتسجيل اتجاه العصب، ثم الحصول على صورة confocal باستخدام ليزر 488 نانومتر ومرشح الانبعاثات المناسبة لGFP قابلة للتنقيح. تعيين قوة الليزر إلى ما يقرب من خمسة أضعاف قوة التصوير العادي والحصول على صورة مع وقت التعرض من ثلاث إلى أربع دقائق، ثم الحصول على صورة أخرى confocal لتسجيل الفلورورات الذاتية قبل التنشيط بعد خطوة التبييض.
رسم خط موازي لمحورات مع طول يساوي حجم إطار التنشيط المطلوب من الصورة برايتفيلد. باستخدام هذا الخط كدليل، رسم منطقة مستطيلة من الفائدة عبر مجال عرض عمودي على المحاور. قم بتنشيط الفلوريس في هذه المنطقة بواسطة الإثارة بالنمط مع ضوء نانومتر 405، مع التأكد من الحصول على صورة قبل التنشيط مباشرةً وبعده.
مع انتهاء التنشيط، ابدأ مؤقت دقيقة واحدة. عندما تنفجر، بدء الحصول على سلسلة timelapse. إضافة 250 ملليغرام من مسحوق الفلوريسين إلى 0.5 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج وخلطه حتى لا يكون هناك جزيئات مرئية، ثم تدور الحل لمدة 30 ثانية في جهاز طرد مركزي الطاولة إلى الرواسب أي مادة غير محلولة.
إضافة ثمانية ميكروليترات من محلول الفلوريسين إلى شريحة وتطبيق رقم 1.5 coverslip. لطخة السائل الزائد، وختم الغطاء مع طلاء الأظافر، والسماح للشريحة لتجف. ضع جانب الأغطية الشريحة إلى أسفل على مرحلة المجهر المقلوب وضبط التركيز على المستوى الرفيع من الفلوراس في سطح الغطاء.
تحريك الشريحة حول العثور على حقل الرؤية التي لا تحتوي على فقاعات الهواء أو جزيئات الفلورسين الكبيرة والحصول على Z-كومة تمتد ستة ميكرومتر في فواصل 0.2 ميكرومتر بحيث الصورة الوسطى هو المستوى التركيز الأصلي. أغلق جميع مصاريع مسار الضوء بما في ذلك مصراع الكاميرا وتعيين قوة الليزر ووقت التعرض إلى صفر ثانية. الحصول على كومة من 100 الصور مع هذه الإعدادات ، والتي سيتم متوسط لتوليد صورة حقل الظلام.
تظهر هنا صور تمثيلية من تجارب الهروب النبضي ونبضات الانتشار. بالنسبة لطريقة الهروب النبضي، يمكن لحركيات تحلل الفلورس في المنطقة المنشطة أن تسفر عن معلومات عن سلوك الإيقاف على المدى الطويل والقصصر. يمكن أن تكون المنطقة التي تم تنشيطها قصيرة لهذه التجارب.
يتم استخدام منطقة أطول تنشيط لطريقة انتشار النبض من أجل توفير مجموعة أكبر من الفلورسنت العصبية. هذا يطيل الوقت الذي يزيد من الفلوريسنس في المناطق التي تحيط يبقى خطيا. وتستخدم هنا 15 ميكرومتر يحيط النوافذ.
وتم تحديد كمية الفلورية الكلية من نافذة القياس. الاضمحلال هو ثنائي المراحل لطريقة النبض والهروب مع اضمحلال أسي الأولي يمثل رحيل الليفية العصبية على المسار الثاني والاضمحلال الأسي أبطأ في 10 إلى 20 دقيقة التي تمثل رحيل خيوط خارج المسار. بالنسبة لاستراتيجية انتشار النبض، تعتمد حسابات سرعة الحركة واتجاهها فقط على المنحدرات في النوافذ المرافقة.
بالنسبة لأطوال النوافذ المستخدمة هنا، تمتد المرحلة الخطية لمدة خمس دقائق تقريباً. يظهر هنا ضوء زمني من العصب المثبطة للجليكية، مما يدل على انخفاض واضح في النقل خارج المنطقة المنشطة. في الواقع ، فإن المنحدرات البعيدة والقريبة أقل بكثير في الأعصاب المعالجة بالمثبط.
وهناك أيضا انخفاض كبير في سرعة السكان بين هذين الشرطين. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أنه من المهم أن تكون متسرعة في إجراء أجزاء التشريح وتجميع الغرفة مع انخفاض صحة الأعصاب بعد التضحية بالحيوان. يمكن أن تسمح ثقافة الخلايا العصبية بقياس وتحليل حركة الليفية الفردية ، والتي من شأنها أن تكمل بيانات النطاق السكاني التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول.
