이 프로토콜은 형광 현미경 검사를 사용하여 청소년 또는 성인 마우스에서 골수화 된 축절 에서 신경 필라멘트 인구의 직접 이미징을 허용하여 고립 된 신경 세그먼트에서 신경 필라멘트 수송의 방향성과 속도를 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 관심있는 단백질의 광액형 형광 융합을 표현하는 마우스의 가용성에 따라 다르지만 쉽게 해부된 신경에서 사용하기 위해 적응 할 수 있습니다. 시작하려면 산소식 식염수에 60 밀리리터 주사기에 붓고 주사기에 최소한의 공기가 남아 있는지 확인하십시오.
주사기를 튜브에 연결한 다음 유출 튜브를 폐기물 플라스크에 넣습니다. 외부 개스킷을 관류 챔버 하우징에 넣고 유동 입구와 콘센트 기둥이 개스킷의 구멍과 정렬되도록 한 다음, 내부 개스킷을 1.5 원형 커버슬립에 놓고 개스킷의 주름을 조심스럽게 매끄럽게 하여 단단한 밀봉을 보장합니다. 커버슬립과 개스킷을 종이 타월에 놓거나 개스킷을 향하여 닦아냅니다.
큰 해부 가위를 사용하여 척추 의 중간 근처 피부에 등색 절개를하고 동물의 복부 측면 주위에 절단계속합니다. 천천히 근육에서 피부를 당기고 근막을 잘라. 다음으로, 미세 절 부 가위를 사용하여 꼬리와 무릎 사이의 허벅지 근육에 절개를하여 좌골 신경을 노출시십시오.
근육을 통해 볼 수있는 신경이 절단되지 않았는지 확인하십시오. 절개를 보조하고 통풍구로 확장하여 근육을 제거한 다음 종아리 근육을 제거하고 상처를 얕고 짧게 유지하여 신경을 손상시키지 않도록 합니다. 신경신경이 상골 신경에서 발 뒤꿈치로 분기되는 지점에서 완전히 드러낼 때까지 근육을 계속 제거하십시오.
척추 근위쪽 끝에 있는 양철 신경을 한 쌍의 집게로 잡고 미세 절 가위로 잘라 신경에 너무 많은 긴장을 가하지 않도록 하십시오. 조심스럽게 근육에서 그것을 들어 올리고 신경에 긴장을 두지 않도록주의, 어떤 첨부 파일을 잘라. 경골 신경의 척추 불경한 끝을 잘라 실온 산소식식염수의 작은 페트리 접시로 옮기습니다.
신경의 근위 쪽 끝에서 시작하여 노출된 축축을 매우 미세한 팁 집게로 부드럽게 잡습니다. 두 번째 포셉으로 신경 칼집을 근교로 잡고 천천히 신경의 말단쪽으로 당겨서 이 과정에서 과도한 긴장이 적용되지 않도록 합니다. 신경의 근근 끝을 잡고 천천히 덮개 슬립에 내려 놓고 부드러운 긴장하에서 곧게 펴습니다.
홈 슬라이드를 사용하여 신경 위에 마이크로 커덕스 슬라이드를 놓고 신경에 평행하게 흐르는 흐름을 배치합니다. 커버슬립 및 마이크로커덕트 어셈블리를 뒤집어 서외부 개스킷에 반대하는 슬라이드로 관류 챔버 하우징에 놓습니다. 증혈 챔버를 고정하려면 금속 하우징에 놓고 잠금 링을 회전시하십시오.
식염수 주사기 플런저를 천천히 누르고 관류 챔버를 채웁니다. 설치 및 이미징 중에 입구와 콘센트 튜브, 콘센트 플라스크 및 주사기를 항상 챔버 자체 위로 높이게 유지하십시오. 주입 어셈블리를 반전 된 현미경 단계로 옮기고 식염수 주사기를 주사기 펌프에 장착 한 다음 모터를 시작하고 분당 0.25 밀리리터의 유량 속도를 조정합니다.
인라인 용액 히터를 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 객관적인 히터를 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 목표에 오일을 적용하고 단계 마운트에 주입 챔버를 삽입합니다.
챔버 히터 패드에 오일을 적용하고 관류 챔버에 부착 한 다음 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다. 발판 챔버를 무대 어댑터에 잠그고 목표 오일을 챔버 밑면의 커버슬립과 접촉하십시오. 브라이트필드 조명을 사용하여 커버슬립 표면에 가장 가까운 신경의 하단 표면에 축축층의 층에 초점을 맞춥니다.
골수화 축축은 대조 향상 없이 브라이트필드 전송 된 빛 조명 에서 볼 수 있는 myelin 칼집의 존재에 의해 식별 될 수있다. 브라이트필드 기준 영상을 획득하여 신경의 방향성을 기록한 다음, 488나노미터 레이저와 광액성 GFP에 적합한 방출 필터를 사용하여 공초점 이미지를 습득한다. 레이저 전력을 약 5배 의 정상 이미징 전력으로 설정하고 노출 시간이 3~4분 인 이미지를 획득한 다음 표백 단계 후 사전 활성화 자동 형광을 기록하기 위해 또 다른 공초점 이미지를 습득합니다.
브라이트필드 이미지의 원하는 활성화 창 크기와 동일한 길이의 축축에 평행선을 그립니다. 이 선을 가이드로 사용하여 축축에 수직으로 뷰 필드에 걸쳐 관심 있는 직사각형 영역을 그립니다. 405 나노미터 빛으로 패턴 여기를 사용하여 이 지역의 GFP 형광을 활성화하여 활성화 직전에 바로 이미지를 획득하도록 합니다.
활성화가 완료되면 1분 타이머를 시작합니다. 꺼지면 타임랩스 시리즈의 인수를 시작합니다. 250 밀리그램의 형광 분말을 이중 증류수 0.5 밀리리터에 넣고 눈에 보이는 입자가 없을 때까지 혼합한 다음 탁상 원심분리기에서 30초 동안 용액을 회전하여 용해되지 않은 물질을 퇴적시킵니다.
슬라이드에 8마이크로리터의 형광액을 추가하고 1.5개의 커버슬립을 적용합니다. 여분의 액체를 블롯하고 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 슬라이드가 건조할 수 있도록하십시오. 슬라이드 커버슬립 측을 반전 된 현미경 단계에 내려 놓고 커버 슬립의 표면에 형광의 얇은 평면에 초점을 조정합니다.
슬라이드를 움직여 기포 또는 큰 형광 입자가 포함되지 않은 시야를 찾고 중간 이미지가 원래 초점 평면인 0.2 마이크로미터 간격으로 6마이크로미터 간격으로 6마이크로미터에 달하는 Z 스택을 획득합니다. 카메라 셔터를 포함한 모든 라이트 패스 셔터를 닫고 레이저 출력과 노출 시간을 0초로 설정합니다. 이러한 설정으로 100개의 이미지 스택을 획득하여 다크 필드 이미지를 생성하기 위해 평균값이 됩니다.
펄스 이스케이프 및 펄스 확산 실험의 대표적인 이미지가 여기에 표시됩니다. 펄스 이스케이프 방법의 경우, 활성화된 영역에서형광 붕괴 역학은 장기 및 단기 일시 중지 동작에 대한 정보를 얻을 수 있다. 활성화된 영역은 이러한 실험에 대해 짧을 수 있습니다.
더 긴 활성화 영역은 형광 신경 필라멘트의 더 큰 풀을 제공하기 위해 펄스 확산 방법에 사용됩니다. 이렇게 하면 측면 영역의 형광 증가가 선형으로 유지되는 시간이 길어집니다. 15 마이크로미터 측면 창은 여기에 사용됩니다.
측정 창으로부터의 총 형광은 정량화되었다. 부패는 궤도 신경 필라멘트의 출발을 나타내는 초기 지수 붕괴와 오프 트랙 필라멘트의 출발을 나타내는 10 ~20 분에 두 번째 느린 기하급수적 인 부패와 펄스 탈출 방법에 대한 biphasic입니다. 펄스 확산 전략의 경우 이동속도와 방향성의 계산은 측면 창의 경사면에만 의존합니다.
여기에 사용된 창 길이의 경우 선형 위상은 약 5분 동안 연장됩니다. 글리코리티억제신경으로부터의 타임랩스가 여기에 표시되어 활성화된 영역으로부터의 수송이 뚜렷하게 감소하는 것을 보여준다. 실제로, 말단과 근위 경사는 억제제로 취급된 신경에서 현저하게 낮습니다.
또한이 두 조건 사이 인구 속도에서 상당한 감소가 있다. 이 프로토콜을 시도할 때, 동물의 희생에 따라 신경 건강이 감소함에 따라 해부 및 챔버 조립 부분을 수행하는 것이 시급하다는 것을 기억하십시오. 신경 세포 배양은 개별 신경 필라멘트의 운동의 측정 그리고 분석을 허용할 수 있습니다.
