פרוטוקול זה מאפשר הדמיה ישירה של אוכלוסיית הנוירופילמנטים באקסונים שעברו מיאלין מעכברים צעירים או בוגרים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ומאפשר למדוד את הכיווניות והמהירות של הובלת נוירופילמנט במקטעי עצב מבודדים. שיטה זו תלויה בזמינותם של עכברים המבטאת היתוך פלואורסצנטי פוטואקטיבי של חלבון העניין, אך ניתן להתאים אותה לשימוש בכל עצב שניתוח בקלות. כדי להתחיל, יוצקים מלוחים מחומצן לתוך מזרק 60 מיליליטר ולהבטיח כי יש אוויר מינימלי שנותר במזרק.
חבר את המזרק לאמבטיה, ולאחר מכן למקם את צינור הזרימה לתוך בקבוק פסולת. מניחים את אטם החיצוני לתוך דיור תא זלוב, להבטיח כי נכנס זרימה והודעות שקע מיושרים עם החורים באטם, ולאחר מכן להניח את אטם הפנימי על מספר 1.5 כיסוי מעגלי בזהירות להחליק את כל הקמטים באטם כדי להבטיח אטם הדוק. מניחים את הכיסוי ואת אטם על מגבת נייר או לנגב את המשימה עם אטם פונה כלפי מעלה.
השתמש זוג מספריים ניתוח גדול לעשות חתך הגבי בעור ליד אמצע עמוד השדרה ולהמשיך לחתוך סביב ההיבט הגחוני של החיה. לאט למשוך את העור מן השריר לחתוך את fascia. לאחר מכן, השתמש מספריים microdissection לעשות חתך בשרירי הירך באמצע הדרך בין הזנב והברך כדי לחשוף את העצב הסיאטי.
ודא כי העצב, אשר נראה דרך השריר, לא נחתך. להאריך את החתך dorsally ו ventrally כדי להסיר את השריר, ולאחר מכן להסיר את השרירים של העגל, שמירה על חתכים רדודים וקצרים, כדי למנוע פגיעה בעצבים. המשיכו להסיר את השרירים עד שעצב הטיביאלי ייחשף במלואו מהנקודה שבה הוא מסתעף מהעצב הסיאטי לעקב.
אחוז בעצב הטיביאלי בקצה הפרוקסימלי של עמוד השדרה עם זוג מלקחיים וגזור אותו עם זוג מספריים microdissection, הקפד לא להחיל יותר מדי מתח על העצב. בזהירות להרים אותו מן השריר לחתוך את כל ההחזקות, דואג לא לשים מתח על העצב. חותכים את הקצה הדיסטלי של עמוד השדרה של עצב הטיביאלי ומעבירים אותו לצלחת פטרי קטנה של תמיסת מלח מחומצן בטמפרטורת החדר.
החל מהקץ הפרוקסימלי של העצב, תופסים בעדינות את קצות האקסון החשופים בזוג מלקשי קצה עדיפים מאוד. עם זוג שני של מטלפים, לתפוס את נדן העצב proximally ולאט לאט למשוך לכיוון הקצה הדיסטלי של העצב לוודא כי אין מתח מיותר מוחל במהלך תהליך זה. לתפוס את הקצה הפרוקסימלי של העצב לאט להניח אותו על כיסוי, ואז ליישר אותו תחת מתח עדין.
מניחים את החלקת המיקרו-מים מעל העצב עם החלקה מחורצת כלפי מטה וממקמים את כיוון הזרימה במקביל לעצב. הופכים את הכיסוי ואת הרכבת המיקרו-אוורור ומ מניחים אותו בתא הזלולה עם המגלשה המתנגדת לאגם החיצוני. כדי לאבטח את תא ההתבוללות, מקם אותו בדיור המתכת וסובב את טבעת הנעילה.
לאט לאט לדכא את הבוכנה מזרק מלוחים ולמלא את תא חליטה. שמור את שקע ושקע צינורות, בקבוק שקע, מזרק מוגבה מעל התא עצמו בכל עת במהלך ההתקנה והדמיה. מעבירים את מכלול ההתנפחות לשלב מיקרוסקופ הפוך והרו את מזרק התמיסת מלח לתוך משאבת המזרק, ואז התחילו את המנוע והתאיימו את המהירות לקצב זרימה של 0.25 מיליליטר לדקה.
חבר את תנור התותב בתוך השורה והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. חבר את התנור האובייקטיבי והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. החל שמן על המטרה ולהכניס את תא שפע לתוך הר הבמה.
החל שמן על כרית תנור התא ולחבר אותו לתא חליטה, ולאחר מכן לחבר אותו ולהגדיר אותו 37 מעלות צלזיוס. נעל את תא ההתווספה לתוך מתאם הבמה והכנס את השמן האובייקטיבי למגע עם המכסה בצד התחתון של התא. השתמש בתאורה של Brightfield כדי להתמקד בשכבת האקסונים על פני השטח התחתונים של העצב הקרוב ביותר למשטח הכיסוי.
אקסונים מירליים ניתן לזהות על ידי נוכחות של נדן מירלין אשר נראה תחת תאורת אור משודרת Brightfield ללא שיפור ניגודיות. לרכוש תמונת התייחסות Brightfield, הקלטת הכיווניות של העצב, ולאחר מכן לרכוש תמונה confocal באמצעות לייזר ננומטר 488 ומסנן פליטה מתאים GFP photoactivatable. הגדר את כוח הלייזר לכוח הדמיה תקין בערך פי חמישה ורכוש תמונה עם זמן חשיפה של שלוש עד ארבע דקות, ולאחר מכן רכוש תמונה קונפוקנטית נוספת כדי לתעד את השפע האוטומטי לפני ההפעלה לאחר שלב ההלבנה.
צייר קו מקביל לאקסונים באורך השווה לגודל הרצוי של חלון ההפעלה של התמונה של ברייטפילד. באמצעות קו זה כמדריך, צייר אזור מלבני של עניין לאורך שדה התצוגה בניצב אל האקסונים. הפעל את פלואורסצנטיות GFP באזור זה על ידי גירוי דפוס עם אור 405 ננומטר, לוודא כי תמונה נרכשת רק לפני ומיד לאחר ההפעלה.
עם סיום ההפעלה, התחל שעון זמן של דקה אחת. כאשר הוא יוצא לדרך, התחל רכישה של סדרת timelapse. מוסיפים 250 מיליגרם של אבקת פלואורסין ל-0.5 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ומערבבים עד שאין חלקיקים נראים לעין, ואז מסובבים את הפתרון במשך 30 שניות בצנטריפוגה על השולחן כדי להזרים כל חומר בלתי פתור.
הוסף שמונה microliters של פתרון פלואורסצין לשקופית ולהחיל מספר 1.5 coverslip. מחקים את הנוזל העודף, אוטמים את הכיסויים בלק, ומאפשרים לשקופית להתייבש. מניחים את צד המכסה של השקופית על שלב המיקרוסקופ ההפוך ומתאימים את ההתמקדות במישור הדק של הפלואורסצנטיות על פני השטח של הכיסוי.
הזז את השקופית מסביב כדי למצוא שדה מבט שאינו מכיל בועות אוויר או חלקיקי פלואורסצין גדולים ולרכוש מחסנית Z המשתרעת על פני שישה מיקרומטר במרווחי מיקרומטר של 0.2 כך שהתמונה האמצעית היא מישור המיקוד המקורי. סגור את כל תריסי נתיב האור כולל תריס המצלמה והגדר את כוח הלייזר ואת זמן החשיפה לאפס שניות. רכוש ערימה של 100 תמונות עם הגדרות אלה, אשר יהיה ממוצע כדי ליצור את תמונת השדה הכהה.
תמונות מייצגות מניסויי בריחה דופק והתפשטות דופק מוצגות כאן. עבור שיטת בריחת הדופק, קינטיקה ריקבון פלואורסצנטי באזור מופעל יכול להניב מידע על התנהגות השהיה לטווח ארוך וקצר. האזור המופעל יכול להיות קצר עבור ניסויים אלה.
אזור פעיל יותר משמש לשיטת התפשטות הדופק על מנת לספק מאגר גדול יותר של נוירופילמנטים פלואורסצנטיים. זה מאריך את הזמן שבו עליית הפלואורסצנטיות באזורי האגף נשארת ליניארית. 15 חלונות אגף מיקרומטר משמשים כאן.
הפלואורסצנטיות המוחלטת מחלון המדידה כומתה. הריקבון הוא דו-פאסי לשיטת בריחת הדופק עם ריקבון אקספוננציאלי ראשוני המייצג את עזיבתם של נוירופילמנטים על המסלול וריקבון מעריכי איטי יותר שני ב 10 עד 20 דקות המייצג את עזיבתם של תריסים מחוץ למסלול. עבור אסטרטגיית התפשטות הדופק, חישובי המהירות והכיוון של התנועה תלויים רק במדרונות בחלונות האגף.
עבור אורכי החלון המשמשים כאן, השלב ליניארי נמשך כחמש דקות. timelapse מ עצב מעוכב גליקוליט מוצג כאן, המדגים ירידה לכאורה בתחבורה מחוץ לאזור הפעיל. ואכן, המדרונות הדיסטליים וה ופרוקסימליים נמוכים משמעותית בעצבים המטופלים במעכבים.
כמו כן חלה ירידה משמעותית במהירות האוכלוסייה בין שני תנאים אלה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי חיוני להיות חפוז בניהול החלקים ניתוח הרכבה התא כמו בריאות העצבים יורדת בעקבות הקרבת החיה. תרבות תאים עצביים יכולה לאפשר מדידה וניתוח של התנועה של neurofilaments בודדים, אשר ישלים את הנתונים בקנה מידה האוכלוסייה שנאספו באמצעות פרוטוקול זה.
