Этот протокол позволяет напрямую визуализацию популяции нейрофиламентов в миелинированных аксонах от несовершеннолетних или взрослых мышей с помощью микроскопии флуоресценции, что позволяет измерить направленность и скорость транспортировки нейрофиламента в изолированных сегментах нерва. Этот метод зависит от наличия мышей, выражаюющих фотоактивируемый флуоресцентный синтез белка интереса, но может быть адаптирован для использования в любом легко рассеченном нерве. Для начала вылейте кислородный солевой раствор в 60 миллилитровый шприц и убедитесь, что в шприце остается минимальный воздух.
Подключите шприц к трубе, а затем поместите трубку оттока в колбу отходов. Поместите внешнюю прокладку в корпус перфузионой камеры, гарантируя, что поток вход и розетки должности выровнены с отверстиями в прокладке, а затем заложить внутреннюю прокладку на номер 1,5 круговой крышкой и тщательно сгладить любые морщины в прокладке, чтобы обеспечить плотный уплотнения. Поместите крышку и прокладку на бумажное полотенце или вытрите задачу прокладкой лицом вверх.
Используйте пару больших ножниц вскрытия, чтобы сделать спинной разрез в коже вблизи середины позвоночника и продолжать резать вокруг брюшной аспект животного. Медленно вытяните кожу от мышцы и вырежьте фасции. Далее, используйте ножницы микроперегибки, чтобы сделать разрез в мышцах бедра на полпути между хвостом и коленом, чтобы разоблачить седалищный нерв.
Убедитесь, что нерв, который виден через мышцу, не вырезать. Расширить разрез dorsally и брюшной удалить мышцы, а затем удалить мышцы теленка, сохраняя сокращений мелкой и короткой, чтобы избежать повреждения нервов. Продолжайте удалять мышцы до тех пор, пока трибиальный нерв полностью подвергается воздействию с точки, где он ветви от седалищного нерва до пятки.
Возьмитесь за ножной нерв в проксимальной конце позвоночника парой типсов и разрежьте его ножницами микроперегибки, убедившись, что не применять слишком много напряжения к нерву. Аккуратно поднимите его от мышцы и отрежьте любые вложения, заботясь о том, чтобы не натяжение нерва. Отрежьте дистальный конец позвоночника тибиального нерва и перенесите его в небольшую чашку Петри комнатной температуры оксигенированного солевого раствора.
Начиная с проксимального конца нерва, осторожно понять подвергаются аксон заканчивается парой очень тонкой миппы кончика. Со второй парой типсов, понять нервной оболочки проксимально и медленно тянуть к дистальной конце нерва убедившись, что не чрезмерное напряжение применяется в ходе этого процесса. Возьмитесь за проксимальный конец нерва и медленно положите его на крышку, а затем выпрямите его под нежным напряжением.
Поместите микроаведук слайд над нервом с рифленый слайд вниз и положение направление потока параллельно нерва. Переверните крышку и сборку микроакедука и поместите его в корпус перфузионной камеры с горкой, противоположной внешней прокладке. Чтобы обезопасить камеру изобилия, поместите ее в металлический корпус и поверните запирающиеся кольца.
Медленно угнетают солевой шприц поршень и заполнить перфузиоюю камеру. Держите вход и розетку трубки, розетки колбу, и шприц поднял над самой камерой во все времена во время установки и изображения. Перенесите сборку изобилия на перевернутый этап микроскопа и смонтировать солевой шприц в шприц-насос, затем запустите двигатель и отрегулируйте скорость для скорости потока 0,25 миллилитров в минуту.
Подключите стационарный обогреватель раствора и установите его до 37 градусов по Цельсию. Подключите объективный обогреватель и установите его до 37 градусов по Цельсию. Нанесите масло на цель и вставьте камеру изобилия в сценическое крепление.
Нанесите масло на панель камерного обогревателя и прикрепите его к перфузиольной камере, затем соедините его и установите до 37 градусов по Цельсию. Заблокив камеру изобилия в адаптер сцены и привести объективное масло в контакт с крышкой на нижней стороне камеры. Используйте освещение Brightfield, чтобы сосредоточиться на слое аксонов на нижней поверхности нерва ближе всего к поверхности крышки.
Миелинированные аксоны можно определить по наличию миелиновой оболочки, которая видна под ярким освещением без контрастного повышения. Приобрети справочное изображение Брайтфилда, записывая направленность нерва, а затем приобрети конфокальные изображения с помощью 488 нанометрового лазера и фильтра выбросов, подходящего для фотоактивируемого GFP. Установите мощность лазера примерно в пять раз больше нормальной мощности изображения и приобретете изображение со временем экспозиции от трех до четырех минут, а затем приобретете другое конфокальные изображения для записи аутофторесценции до активации после шага отбеливания.
Нарисуйте линию параллельно аксонов с длиной, равной желаемому размеру окна активации изображения Брайтфилда. Используя эту линию в качестве руководства, нарисуйте прямоугольную область интереса через поле зрения перпендикулярно аксонов. Активируйте флуоресценцию GFP в этом регионе путем возбуждения шаблона при свете 405 нанометров, убедившись, что изображение получено непосредственно перед активацией и сразу после нее.
По мере завершения активации запустите одноминутный таймер. Когда он уходит, начать приобретение таймлапс серии. Добавьте 250 миллиграммов порошка флуоресксейна в 0,5 миллилитров двойной дистиллированной воды и смешайте его до тех пор, пока не будет видимых частиц, затем вращайте раствор в течение 30 секунд в центрифуге столешницы, чтобы от осадки любого несоленого материала.
Добавьте восемь микролитров раствора флуоресцеина в слайд и нанесите на нее крышку номер 1.5. Пятно избыток жидкости, печать крышки с лаком для ногтей, и дайте слайд высохнуть. Поместите слайд-крышку вниз на перевернутую стадию микроскопа и отрегулируйте фокус на тонкой плоскости флуоресценции на поверхности крышки.
Перемести слайд вокруг, чтобы найти поле зрения, которое не содержит пузырьков воздуха или крупных частиц флуоресцеина и приобрести стек, охватывающий шесть микрометров с интервалом 0,2 микрометра, таким образом, что среднее изображение является исходной плоскостью фокусировки. Закройте все ставни пути света, включая затвор камеры и установите мощность лазера и время экспозиции до нуля секунд. Приобрети стопку из 100 изображений с этими настройками, которые будут усреднели для создания изображения темного поля.
Здесь показаны репрезентативные изображения из экспериментов по пульсу и распространению импульсов. Для импульсного метода, флуоресценции распада кинетики в активированной области может дать информацию о долгосрочной и краткосрочной паузы поведения. Активированный регион может быть коротким для этих экспериментов.
Более длинная активированная область используется для метода распространения импульса, чтобы обеспечить больший пул флуоресцентных нейрофиламентов. Это удлиняет время, в течение которого увеличение флуоресценции в фланговых областях остается линейным. Здесь используются 15 микрометровых фланговых окон.
Общая флуоресценция из измерительного окна была количественно оценена. Распад является бифазным для импульса-бежать метод с первоначальным экспоненциальным распадом, представляющих отъезд на треке нейрофиламентов и второй медленнее экспоненциального распада на 10 до 20 минут, что представляет собой отход вне дорожки нити. Для стратегии распространения импульса расчеты скорости и направленности движения зависят только от склонов в фланговых окнах.
Для длины окна, используемой здесь, линейная фаза простирается примерно на пять минут. Здесь показан таймлапс из гликолитически ингибируется нерв, демонстрирующий явное сокращение транспортировки из активированной области. Действительно, дистальные и проксимальные склоны значительно ниже в нервах, обработанных ингибитором.
Существует также значительное снижение скорости населения между этими двумя условиями. При попытке этого протокола, помните, что очень важно быть поспешным в проведении вскрытия и камеры сборки части, как здоровье нерва снижается после жертвоприношения животного. Культура нейронных клеток может позволить измерения и анализа движения отдельных нейрофиламентов, которые будут дополнять данные масштаба населения, собранные с помощью этого протокола.
