不同的机械载荷参数可以诱导肌腱衍生的STEM细胞分化成不同的细胞。我们介绍了应用这种三维单轴机械刺激生物反应器系统来诱导肌腱衍生STEM细胞的畸基因分化的详细过程。肌腱病是骨科常见的运动损伤之一。
在排球、篮球、田径、手球和足球运动员中，跟腱病的存在最常见，高达29%，而肌腱病的存在也很高。然而，由于肌腱自我治疗能力有限，缺乏有效的治疗，肌腱病对患者的生活质量仍有显著的负面影响。肌腱衍生的STEM细胞，被称为TDSC作为肌腱细胞的重要前体细胞，在肌腱病的发展，以及肌腱病后的功能和结构恢复中起着重要的作用。
然而，与机械载荷参数的不同，如载荷应力、载荷频率、载荷类型和载荷周期，可诱导TDSC分化成不同的电池。因此，一个有效和有效的机械载荷制度对于肌腱的成因非常重要。本协议分为七个阶段，包括小鼠TDSC的分离、小鼠TDSC的培养和扩张、细胞片形成刺激培养、刺激培养培养的细胞片的形成、3D肌腱STEM细胞结构的准备、单轴细胞拉伸机械刺激复合物的组装以及体外肌腱类组织机械刺激的评估。
小鼠TDSC的隔离。用于六到八周大的小鼠宫颈脱位。收获肌腱和跟腱。
消化肌腱与六毫升1型胶原酶三小时。收集细胞，培养它完整的α MEM含有10%的FBS和1%的链霉素和青霉素混合物7天。使用荧光激活细胞分选（通过流式细胞学）识别DSDC，通过细胞表面标记的表达（包括CD44、CD90和Sca-1） 进行识别。
缺少 CD34 和 CD45 的表达式。通过和冻结细胞。通过单元格将用于进一步的步骤。
小鼠TDSC的培养和扩展。以热身小鼠肌腱STEM细胞。慢慢添加额外的四到五毫升的完整α MEM。
通过移液器将混合物转移到15毫升离心管中。用移液器用中到总八毫升的中到八毫升来顶。将管子放入离心机，保持平衡。
在347g下离心细胞5分钟。从离心机中拿出一根管子。检查底部的颗粒。
释放自由介质。在一到两毫升完整的介质中轻轻悬浮细胞。避免制造太多的气泡。
通过移液器将重新悬浮的细胞转移到 T75 烧瓶中。使用移液器将完整的α MEM介质添加到烧瓶中，达到总体积为10毫升，最终浓度为每平方厘米13，000个细胞。将烧瓶放入孵化器中，在37度培养瓶，用5%的二氧化碳进行养殖。
每三天更换一次介质。在改变培养介质时，观察和监测显微镜下的细胞，直到细胞被培养到100%汇合。为细胞片形成准备刺激培养培养。
将 15 毫升完整的 α MEM 介质倒入 15 毫升无菌管中。在15毫升介质中加入6微升抗坏血酸，最终浓度为每毫升4.4微克。通过上下反转轻轻混合。
细胞片的形成，通过培养刺激介质。小心丢弃非正常完整的阿尔法 MEM 介质。避免触摸附着在烧瓶底部的细胞。
慢慢加入10毫升刺激中等。避免对完全汇合的细胞造成任何干扰。培养刺激培养的细胞9天，每三天改变一次培养基，在37度时用5%的二氧化碳充分生成细胞片。
3D肌腱STEM细胞结构的准备。把烧瓶从孵化器里拿出来完全丢弃刺激介质。
通过旋转烧瓶，用 PBS 清洗单层细胞片。完全丢弃 PBS。使用移液器将一毫升、0.25% 的 trypsin 添加到烧瓶的一角。
点击烧瓶的一角，分离单层细胞片，直到细胞片的一角从烧瓶底部洗掉。立即添加九毫升完整的α MEM介质，以停止三辛化的反应。继续旋转烧瓶，以完全剥下单层细胞片。
倒出总计，用介质将细胞片附到培养皿中。使用无菌钳子拾取细胞片的一角，顺时针方向旋转 15 次。拾取细胞片的另一端，沿逆时针方向旋转 10 次，形成跟腱状的体外构造。
在独特的设计生物反应器中组装单轴拉伸机械刺激复合体。通过连接器连接挂钩，然后在两个挂钩之间调整为两厘米。轻轻风 3D TDSC 构造在每个挂钩上的演示挂钩上三次。
通过拧紧两端的螺钉，将带电池结构的挂钩固定到生物反应器的腔室上。用完整的α MEM 介质填充腔室。用电缆将加速器连接到培养室。
用无菌钳子切割挂钩接头。打开电源和通道控制器以启动机械刺激。将盖子盖在腔室上，跟踪指示灯，并确保生物反应器正常工作。
将生物反应器放入培养箱中，使三元细胞结构受到机械拉伸。装载系统为 6% 应变，0.25 赫兹频率，8 小时后 16 小时休息 6 天。评估机外肌腱样组织的机械刺激。
用螺丝刀松开螺钉，小心地拆下组件。将肌腱样组织放入4%PFA中固定15分钟，将固定肌腱样组织放入活检盒中，并由宠物进行活检。使样品脱水的过程。
最后，通过HD组织学地位进行评估。重复整个方案，从肌腱样组织中提取RNA，通过qPCR评估致畸标记的表达。在机械刺激之前，TDSC 将在完整的介质中增长到 100% 汇合，并显示一个混乱的外在结构形态。
六天后，您接下来看到拉伸、机械加载、额外的细胞矩阵和细胞对齐都很好地定向了。机械装载后，电池填充良好，并密罩在 ECM 中。细胞形态呈现为定位，与没有拉伸的肌腱细胞相比，与正常肌腱细胞更相似。
带载荷的细胞构造中的细胞密度高于无载荷的细胞密度。qPCR结果表明，与所述培养物相比，目前物质增加了致畸标记物的表达，包括scleraxis、莫霍克、特诺多林和1型胶原蛋白。在机械刺激生物反应器系统方面，采用线性电机分离室。
由于它可以提供精确的机械载荷，并且与传统2D细胞表和双轴拉伸相比，它便于携带和易于调整，因此3D细胞结构更类似于肌腱的真实形状。单轴拉伸更类似于肌腱细胞的强度特征。这为使用3D单轴拉伸系统促进TDSC的分化提供了理论依据。
因此，2D单元格板最终被路由到3D单元构造中，并在本协议中进行了单轴处理。根据我们的生物反应器系统，我们的装载系统是6%应变，0.25赫兹频率，8小时，然后16小时休息6天。最后，通过形态学和致原性标记的表达水平证明了协议的有效性。
整个操作过程简单，但操作人员要注意随时保持TDSC的环境消毒。我们的协议有许多应用。刺激TDSC模拟体内分化的过程有助于肌腱病病理过程的调查。
此外，该协议为TDSC定向分化为肌腱样组织提供了一种可重复的方法。因此，它可以简单而有效地用于潜在的工程肌腱培养。综上关于应用三轴机械刺激生物反应器系统简单、经济、可重复、诱导TDSC的畸抗分化的有效方法。
我们的协议提供了整个过程的细节。
