다른 기계적 적재 파라미터는 다른 세포로 분화 된 힘줄 유래 STEM 세포를 유도 할 수 있습니다. 이 3차원 단종 동종 기계 자극 생물반응기 시스템을 적용하여 힘줄 유래 STEM 세포의 테노겐성 분화를 유도하는 상세한 과정을 소개합니다. 텐디노병증은 정형 외과 부서에서 일반적인 스포츠 부상 중 하나입니다.
아킬레스 건병증의 존재는 중장거리 주자의 경우 최대 29%로 가장 일반적이며, 슬개골 건비나병증의 존재는 배구, 농구, 육상, 핸드볼, 축구 선수에서도 높습니다. 그러나, 힘줄의 제한된 자기 치유 능력과 효과적인 치료의 부족으로 인해, 힘줄병증은 여전히 환자의 삶의 질에 상당한 악영향을 미친다. 힘줄 세포의 중요한 전구체 세포로 TDSC로 알려진 힘줄 유래 STEM 세포는 힘줄 병증 후의 기능적 및 구조 적 복원뿐만 아니라 힘줄 병증의 발달에 중요한 역할을합니다.
하중 응력, 적재 빈도, 적재 유형 및 적재 기간과 같은 기계적 적재 매개 변수와는 달리 TDSC가 다른 셀로 분화하도록 유도할 수 있습니다. 따라서, 효과적이고 유효한 기계 적재 정권은 힘줄 기원에 매우 중요합니다. 현재 의정서의 분리, 마우스 TDSC의 분리, 마우스 TDSC의 배양 및 확장, 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지 의 준비, 자극 매체에서 배양하여 세포 시트 형성, 3D 힘줄 줄기 세포 구성준비, 기계적 자극 복합체를 스트레칭하는 동축 세포의 조립, 조직 과 같은 조직 자극의 기계적 자극의 평가를 포함하는 7개의 단계가 있다.
마우스 TDSC의 격리. 자궁 경부 탈구에 의해 6 8 주 된 마우스에서 사용. 슬개골 힘줄과 아킬레스 건을 수확하십시오.
6 밀리리터 타입 1 콜라게나아제로 3시간 동안 소화. 7 일 동안 FBS의 10 %와 연쇄 상균 및 페니실린 혼합물의 1 %를 포함하는 완전한 알파 MEM에서 세포를 수집하고 배양하십시오. CD44, CD90 및 Sca-1을 포함한 세포 표면 마커의 발현, 유동 세포 측정, 세포 표면 마커의 발현에 의한 형광 활성 셀 정렬을 사용하여 TDSC를 식별합니다.
CD34 및 CD45의 표현이 부족합니다. 세포를 통과하고 동결합니다. 통로 세포는 추가 단계에 사용됩니다.
마우스 TDSC의 배양 및 확장. 워밍업된 마우스 힘줄 줄기 세포를 섭취하십시오. 천천히 완전한 알파 MEM의 4 ~ 5 밀리리터를 추가합니다.
파이펫으로 혼합물을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기다. 파이펫으로 총 8 밀리리터에 중간크기로 위로 올려보있습니다. 튜브를 원심분리기에 잘 배치합니다.
원심 분리기 세포는 347 g에서 5 분 동안. 원심분리기에서 튜브를 꺼내라. 하단의 펠릿을 확인합니다.
자유 매체를 데산합니다. 1~2밀리리터 완전 배지에서 세포를 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 너무 많은 거품을 하지 마십시오.
다시 중단된 셀을 파이펫으로 T75 플라스크로 옮기습니다. 파이펫을 사용하여 플라스크에 완전한 알파 MEM 배지를 추가하여 평방 센티미터당 13, 000 셀의 최종 농도로 총 10 밀리리터에 도달하십시오. 플라스크를 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%로 37도에서 배양합니다.
3일마다 매체를 변경합니다. 세포가 100%의 합류로 배양될 때까지 배지를 변경할 때 현미경으로 세포를 관찰하고 모니터링한다. 세포 시트 형성을 위한 자극 배양 배지의 준비.
15 밀리리터 완전 알파 MEM 배지를 15 밀리리터 멸균 튜브에 붓습니다. 6 개의 마이크로 리터 아스코르브 산을 15 밀리리터 배지에 넣고 밀리리터 당 4.4 마이크로그램의 최종 농도를 추가하십시오. 위아래로 반전하여 부드럽게 섞는다.
자극 배지에서 배양하여 세포 시트 형성. 비정상 완전 알파 MEM 배지를 신중하게 폐기하십시오. 플라스크 바닥에 부착된 셀을 만지지 마십시오.
10 밀리리터 자극 매체를 천천히 추가합니다. 완전히 물기 있는 세포에 방해를 주지 마십시오. 9일 동안 자극 배지에서 세포를 배양하고 3일마다 배지를 변경하여 이산화탄소의 5%를 37도에서 충분히 생성한다.
3D 힘줄 줄기 세포 구조의 준비. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내십시오. 자극 매체를 완전히 폐기하십시오.
플라스크를 소용돌이쳐 PBS로 단층 셀 시트를 씻으십시오. PBS를 완전히 폐기하십시오. 파이펫을 사용하여 플라스크 모서리에 0.25%의 트립신을 1밀리리터, 0.25%를 추가합니다.
플라스크의 모서리를 눌러 단층 셀 시트의 모서리가 플라스크 의 바닥에서 세차할 때까지 단층 셀 시트를 분리합니다. 즉시 트립시화의 반응을 중지 9 밀리리터 전체 알파 MEM 매체를 추가합니다. 플라스크를 계속 소용돌이쳐 단층 셀 시트를 완전히 벗겨냅니다.
총량을 부어 페트리 접시에 매체를 부착합니다. 멸균 트위저를 사용하여 셀 시트의 한 쪽 모서리를 선택하고 시계 방향으로 15회 회전합니다. 셀 시트의 또 다른 끝을 선택하고 시계 반대 방향으로 회전하여 힘줄과 같은 체외 구조를 공식화합니다.
독특한 설계된 생물 반응기의 단축 스트레칭 기계 자극 복합체의 조립. 커넥터별로 후크를 연결한 다음 두 후크 사이에 2센티미터로 조정합니다. 데모 후크에서 3D TDSC 구성을 각 후크에서 세 번 부드럽게 감습니다.
두 끝에 나사를 조이면 생물 반응기의 챔버에 세포 구조로 후크를 고정합니다. 완전한 알파 MEM 배지로 챔버를 채웁니다. 케이블로 액셀러레이터를 배양챔버에 연결합니다.
멸균 핀셋으로 후크 커넥터를 잘라냅니다. 전원 및 채널 컨트롤러를 켜서 기계적 자극을 시작합니다. 챔버에 뚜껑을 놓고 표시등을 추적하고 생물 반응기가 제대로 작동 할 수 있는지 확인합니다.
생체 반응기를 인큐베이터에 넣고 3D 세포 구조를 기계적 스트레칭으로 처리합니다. 로딩 정권은 6%의 변형률, 0.25 Hertz 주파수, 8시간 후 6일 동안 16시간 휴식입니다. 체외 힘줄 과 같은 조직에서 자극 된 기계적 평가.
드라이버에 의해 나사를 풀고 조심스럽게 조립을 벗습니다. 힘줄 과 같은 조직을 4 %의 PFA에 넣고 15 분 동안 고정, 애완 동물의 생검과 생검 카세트에 고정 힘줄 같은 조직을 배치. 샘플을 탈수하는 공정.
그리고 마지막으로, HD 조직적 서에 의해 평가. qPCR에 의한 테노겐성 마커의 발현을 평가하기 위한 힘줄과 같은 조직에서 전체 프로토콜을 반복하고 RNA를 추출한다. 기계적 자극 전에 TDSC는 완전한 매체에서 100%의 합류로 성장하고 무질서한 외부 구조 형태를 표시합니다.
6일 후에 는 스트레칭, 기계 적재, 여분의 세포 매트릭스 및 셀 정렬을 잘 지향했습니다. 세포는 기계적 적재 후 ECM에 잘 채워지고 잘 포위되었습니다. 세포 형태는 위치하도록 제시되었고 스트레칭없이 일반 힘줄 세포와 더 유사하였다.
적재를 가진 세포 구조의 세포 밀도는 적재없이 하나보다 높았다. qPCR 결과는 현재의 문제가 명시된 문화에 의해 처리되는 것과 비교하여 슬러액, 모호크, 테노모둘린 및 타입-1 콜라겐을 포함하는 테노겐 마커의 발현을 증가시켰다는 것을 보여주었다. 기계적 자극 생물 반응기 시스템의 관점에서, 선형 모터와 분리 챔버는 우리의 현재 프로토콜에 사용되었다.
정확한 기계적 적재를 제공할 수 있고 기존의 2D 셀 시트 및 양축 스트레치 방식에 비해 이식성이 뛰어나고 쉽게 조절할 수 있기 때문에 3D 셀 구조는 힘줄의 실제 형상과 더 유사합니다. 그리고 단종 스트레칭은 힘줄 세포의 강점 특성과 더 유사하다. 이는 TDSC의 분화를 자극하기 위해 3D 단방향 스트레치 시스템을 사용하는 이론적 근거를 제공합니다.
따라서, 2D 세포 시트는 마침내 3D 세포 구조로 라우팅되었고 본 프로토콜에서 단원도를 겪었다. 우리의 생물 반응기 시스템에 따르면, 우리의 적재 정권은 6 %의 변형, 0.25 Hertz 주파수, 8 시간 6 일 동안 16 시간 휴식. 마지막으로, 프로토콜의 효과는 형태학 및 발성 마커의 발현 수준에 의해 입증되었다.
전체 작동 과정은 간단하지만 운영자는 TDSC의 환경을 항상 살균하기 위해주의를 기울여야합니다. 프로토콜의 많은 응용 프로그램이 있습니다. 생체 내 분화를 모방하기 위해 TDSC를 자극하는 과정은 건병증의 병리학 적 과정을 조사하는 데 도움이됩니다.
게다가, 이 프로토콜은 힘줄 같이 조직으로 TDSC의 지시된 분화를 위한 재현가능한 방법을 제공합니다. 따라서 잠재적인 엔지니어링 힘줄 문화에 간단하고 효과적으로 사용할 수 있습니다. 요약하자면, 3D 단색 동방기계 자극 생물반응기 시스템을 적용하는 것은 간단하고 경제적이며 재현가능하며 TDSC의 세포화 분화를 유도하는 유효한 방법이다.
우리의 프로토콜은 세부 사항의 전체 프로세스를 제공합니다.
