Verschiedene mechanische Belastungsparameter könnten sehnenabgeleitete MINT-Zellen induzieren, die in verschiedene Zellen differenziert sind. Wir führen ein detailliertes Verfahren zur Anwendung dieses dreidimensionalen uniaxialen mechanischen Stimulations-Bioreaktorsystems ein, um tenogene Differenzierung von sehnsättabgeleiteten STEM-Zellen zu induzieren. Die Tendinopathie ist eine der häufigsten Sportverletzungen in der orthopädischen Abteilung.
Das Vorhandensein von Achillessehnenopathie ist am häufigsten mit bis zu 29% für Mittel- und Langstreckenläufer, während das Vorhandensein von Patella Tendinopathie ist auch hoch bei Athleten der Volleyball, Basketball, Leichtathletik, Handball und Fußball. Aufgrund der begrenzten Selbstheilungsfähigkeit der Sehne und des Mangels an wirksamer Behandlung hat die Tendinopathie jedoch immer noch erhebliche negative Auswirkungen auf die Lebensqualität der Patienten. Tendon-abgeleitete STEM-Zellen, bekannt als TDSCs als wichtige Vorläuferzellen von Sehnenzellen, spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Teninopathie sowie ihrer funktionellen und strukturellen Wiederherstellung nach der Tendinopathie.
Abweichende mechanische Belastungsparameter wie Belastungsspannung, Ladefrequenz, Ladeart und Ladezeit können jedoch dazu führen, dass sich TDSCs in verschiedene Zellen differenzieren. Daher ist ein wirksames und gültiges mechanisches Belastungsregime für die Sehnengenese von großer Bedeutung. Es gibt sieben Stadien des vorliegenden Protokolls, einschließlich Isolierung von Mäuse-TDSCs, Kultur und Expansion von Mäuse-TDSCs, Vorbereitung von Stimulationskulturmedium für die Zellblattbildung, Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium, Vorbereitung des 3D-Sehnen-STAMMzellkonstrukts, Montage der uniaxialen Zellen, die den mechanischen Stimulationskomplex dehnen, und Auswertung des mechanisch stimulierten in vitro sehnenähnlichen Gewebes.
Isolierung von Mäusen TDSCs. Wird bei Mäusen verwendet, die sechs bis acht Wochen alte Mäuse durch Zervixdislokation sind. Patellasehnen und Achillessehnen ernten.
Sehne mit sechs Milliliter Nbissentyp 1 Kollagenase für drei Stunden verdauen. Sammeln Sie die Zellen und Kultur es in vollständig alpha MEM enthält 10% von FBS und 1% von Streptomycin und Penicillin-Mischung für sieben Tage. TDSCs mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung durch Durchflusszytometrie, Expression von Zelloberflächenmarkern, einschließlich CD44, CD90 und Sca-1, zu identifizieren.
Fehlen Sie den Ausdruck von CD34 und CD45. Durchgangs- und Gefrierzellen. Durchgangee Zellen werden für weitere Schritte verwendet.
Kultur und Erweiterung von Mäusen TDSCs. Nehmen Sie die aufgewärmten MäuseSehnen-STEM-Zellen. Fügen Sie langsam zusätzliche vier bis fünf Milliliter komplette alpha MEM.
Übertragen Sie das Gemisch mit einer Pipette in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr. Mit einem Medium von insgesamt acht Millilitern durch eine Pipette aufladen. Legen Sie das Rohr in Zentrifuge ein gut ausbalanciert.
Zentrifugenzellen bei 347 g für fünf Minuten. Nehmen Sie ein Rohr aus der Zentrifuge. Überprüfen Sie das Pellet an der Unterseite.
Dekant das freie Medium. Setzen Sie Zellen sanft in einem bis zwei Milliliter komplettem Medium wieder auf. Vermeiden Sie es, zu viele Blasen zu machen.
Übertragen Sie wieder suspendierte Zellen mit einer Pipette in einen T75-Kolben. Verwenden Sie eine Pipette, um dem Kolben ein komplettes Alpha-MEM-Medium hinzuzufügen, um ein Gesamtvolumen von 10 Milliliter mit der Endkonzentration von 13.000 Zellen pro Quadratzentimeter zu erreichen. Legen Sie den Kolben in den Inkubator und kulturieren Sie ihn bei 37 Grad mit 5% Kohlendioxid.
Ändern Sie das Medium alle drei Tage. Beobachten und überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, wenn Sie das Medium verändern, bis die Zellen zu 100% zusammengezäunt wurden. Vorbereitung des Stimulationskulturmediums für die Zellblattbildung.
Gießen Sie 15 Milliliter komplette alpha MEM Medium in eine 15 Milliliter sterile Röhre. Fügen Sie sechs Mikroliter Ascorbinsäure in 15 Milliliter Medium auf die endgültige Konzentration von 4,4 Mikrogramm pro Milliliter. Mischen Sie sanft, indem Sie auf und ab.
Zellblattbildung durch Kultivierung im Stimulationsmedium. Entsorgen Sie das nicht-normale vollständige alpha MEM-Medium sorgfältig. Vermeiden Sie es, die Zellen zu berühren, die an der Unterseite des Kolbens befestigt sind.
Fügen Sie 10 Milliliter Stimulation Medium langsam. Vermeiden Sie Störungen der vollständig konfluenten Zellen. Kultur die Zellen in Stimulation Medium für neun Tage und ändern Sie das Medium alle drei Tage, um ausreichend Zellblatt bei 37 Grad mit 5% Kohlendioxid zu erzeugen.
Vorbereitung des 3D-Sehnen-STAMMzellkonstrukts. Nehmen Sie den Kolben aus dem Brutkasten. Entsorgen Sie das Stimulationsmedium vollständig.
Waschen Sie das monolayer Zellblatt mit PBS, indem Sie den Kolben wirbeln. Entsorgen Sie die PBS vollständig. Verwenden Sie eine Pipette, um einen Milliliter, 0,25%Trypsin in die Ecke des Kolbens hinzuzufügen.
Tippen Sie auf die Ecke des Kolbens, um das einschichtige Zellblatt zu lösen, bis die Ecke des Zellblatts den Boden des Kolbens abwäret. Fügen Sie sofort neun Milliliter komplette alpha MEM Medium, um die Reaktion der Trypsinisierung zu stoppen. Wirbeln Sie den Kolben weiter, um das monolayer Zellblatt vollständig abzuziehen.
Gießen Sie die Summe aus, um das Zellblatt in Petrischale mit Medium zu befestigen. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um eine Ecke des Zellblatts aufzunehmen und 15 Mal im Uhrzeigersinn zu drehen. Nehmen Sie ein anderes Ende des Zellblattes auf und drehen Sie 10 Mal gegen den Uhrzeigersinn, um ein sehnenartiges In-vitro-Konstrukt zu formulieren.
Montage des uniaxial-dehnenden mechanischen Stimulationskomplexes in einem einzigartigen Bioreaktor. Schließen Sie die Haken über den Stecker an, und stellen Sie sie dann auf zwei Zentimeter zwischen zwei Haken ein. Wickeln Sie die 3D-TDSCs auf dem Demo-Hook für dreimal auf jedem Haken.
Sichern Sie die Haken mit Zellkonstrukt auf die Kammer des Bioreaktors, indem Sie die Schrauben an zwei Enden anziehen. Füllen Sie die Kammer mit dem kompletten alpha MEM Medium. Verbinden Sie den Beschleuniger über Kabel mit der Kulturkammer.
Schneiden Sie den Haken-Stecker durch eine sterile Pinzette. Schalten Sie den Strom- und Kanalregler ein, um eine mechanische Stimulation zu starten. Setzen Sie den Deckel auf die Kammer, verfolgen Sie die Kontrollleuchten und stellen Sie sicher, dass der Bioreaktor ordnungsgemäß funktionieren kann.
Legen Sie den Bioreaktor in den Inkubator und unterwerfen Sie das 3D-Zellkonstrukt der mechanischen Dehnung. Das Laderegime beträgt 6%, 0,25 Hertz Frequenz, acht Stunden gefolgt von 16 Stunden Ruhe für sechs Tage. Bewertung des mechanisch stimulierten in vitro sehnenähnlichen Gewebes.
schrauben Sie die Schrauben mit einem Schraubendreher und nehmen Sie die Montage vorsichtig ab. Legen Sie das sehnenartige Gewebe für die Fixierung 15 Minuten in 4%PFA, legen Sie das fixierte sehnenähnliche Gewebe in eine Biopsiekassette mit Biopsie von Haustieren. Verfahren zur Dehydrierung einer Probe.
Und schließlich, nach HD histologische Stand. Wiederholen Sie das gesamte Protokoll und extrahieren Sie RNA aus dem sehnenähnlichen Gewebe, um die Expression tenogener Marker durch qPCR zu bewerten. Vor der mechanischen Stimulation wachsen TDSCs bis zu 100% Zusammenfluss in vollständigem Medium und zeigen eine unorganisierte äußere Strukturmorphologie an.
Nach sechs Tagen sahen Sie als nächstes Dehnung, mechanische Belastung, zusätzliche zelluläre Matrix, und die Zellausrichtungen waren gut orientiert. Die Zellen waren gut bestückt und nach mechanischer Beladung gut in ECM eingehüllt. Die Zellmorphologie wurde dargestellt, um lokalisiert zu werden und war eher ähnlich wie normale Sehnenzellen im Vergleich zu denen mit ohne Dehnung.
Die Zelldichte im Zellkonstrukt mit Belastung war höher als die ohne Belastung. qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die vorliegenden Sachverhalte die Expression tenogener Marker, einschließlich Skleraxis, Mohawk, Tenomodulin und Typ 1 Kollagen, im Vergleich zu denen, die mit der angegebenen Kultur behandelt wurden, erhöhten. In Bezug auf das mechanische Stimulations-Bioreaktorsystem wurde in unserem heutigen Protokoll eine getrennte Kammer mit Linearmotor verwendet.
Da es eine genaue mechanische Belastung bieten kann und es tragbar und leicht angepasst werden kann, verglichen mit der Art und Weise, wie das traditionelle 2D-Zellenblech und die biaxiale Dehnung, 3D-Zellkonstrukt ist eher ähnlich der realen Form der Sehne. Und die uniaxiale Dehnung ist eher den Stärken von Sehnenzellen ähnlich. Dies bietet eine theoretische Grundlage für die Verwendung von 3D uniaxial gestrecktsystem, um die Differenzierung von TDSCs zu stimulieren.
So wurden 2D-Zellbleche schließlich in ein 3D-Zellkonstrukt geroutet und im vorliegenden Protokoll uniaxial unterzogen. Nach unserem Bioreaktorsystem beträgt unser Laderegime 6%Dehnung, 0,25 Hertz Frequenz, acht Stunden gefolgt von 16 Stunden Ruhe zeitgemäß für sechs Tage. Schließlich wurde die Wirksamkeit des Protokolls durch Morphologie und die Expressionsstufe tenogener Marker nachgewiesen.
Der gesamte Betriebsprozess ist einfach, aber der Bediener muss darauf achten, dass die Umgebung von TDSC jederzeit sterilisiert wird. Es gibt viele Anwendungen unseres Protokolls. Der Prozess der Stimulierung von TDSCs zur Nachahmung der Differenzierung in vivo ist hilfreich für die Untersuchung des pathologischen Prozesses der Tendinopathie.
Außerdem bietet dieses Protokoll eine reproduzierbare Methode zur gezielten Differenzierung von TDSCs in sehnenähnliches Gewebe. So kann es einfach und effektiv für potenzielle technische Sehnenkultur verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung eines 3D-Uniaxial-Bioreaktorsystems einfach, wirtschaftlich, reproduzierbar und eine gültige Methode zur Induzieren tenogener Differenzierung von TDSCs ist.
Unser Protokoll liefert den gesamten Prozess im Detail.
