Diferentes parámetros de carga mecánica podrían inducir células STEM derivadas del tendón diferenciadas en diferentes células. Introducimos un proceso detallado de aplicación de este sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional para inducir la diferenciación tenogénica de las células STEM derivadas del tendón. La tendinopatía es una de las lesiones deportivas comunes en el departamento ortopédico.
La presencia de tendinopatía de Aquiles es más común con hasta un 29% para corredores de media y larga distancia, mientras que la presencia de tendinopatía de rótula también es alta en atletas de voleibol, baloncesto, atletismo, balonmano y fútbol. Sin embargo, debido a la limitada capacidad de autocuración del tendón y la falta de tratamiento eficaz, tendinopatía todavía tiene un efecto adverso significativo en la calidad de vida de los pacientes. Las células STEM derivadas del tendón, conocidas como ETSC como las células precursoras importantes de las células tendones, desempeñan un papel importante en el desarrollo de la tendinopatía, así como su restauración funcional y estructural después de la tendinopatía.
Sin embargo, diferentes a los parámetros de carga mecánica, como la tensión de carga, la frecuencia de carga, el tipo de carga y el período de carga pueden inducir a los TDSC a diferenciarse en diferentes celdas. Por lo tanto, un régimen de carga mecánica eficaz y válido es muy significativo para la génesis del tendón. Hay siete etapas del presente protocolo, incluyendo el aislamiento de ratones TDSCs, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células STEM de tendón 3D, montaje de las células uniaxiales que estiran el complejo de estimulación mecánica, y evaluación del tejido mecánico estimulado in vitro similar al tendón.
Aislamiento de ratones TDSCs. Se utiliza en ratones de seis a ocho semanas de edad por luxación cervical. Cosecha los tendones de la rótula y los tendones de Aquiles.
Digestión tendón con seis mililitros tipo 1 colágeno durante tres horas. Recoger las células y cultivarlo en meM alfa completo que contiene 10% de FBS y 1%de la mezcla de estreptomicina y penicilina durante siete días. identificar los TDSC mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia por citometría de flujo, expresión de marcadores de superficie celular, incluidos CD44, CD90 y Sca-1.
Falta de la expresión de CD34 y CD45. Pasaje y congelación de células. Las celdas pasadas se utilizarán para otros pasos.
Cultura y expansión de ratones TDSC. Tome las células STEM del tendón de ratones calentadas. Agregue lentamente cuatro a cinco mililitros de MEM alfa completo.
Transfiera la mezcla a un tubo centrífugo de 15 mililitros mediante una pipeta. Recargar con un medio a un total de ocho mililitros por una pipeta. Coloque el tubo en centrifugar un equilibrio de pozo.
Células centrífugas a 347 g durante cinco minutos. Saca un tubo de la centrífuga. Compruebe el pellet en la parte inferior.
Decantar el medio libre. Vuelva a suspender las células suavemente en un medio completo de uno a dos mililitros. Evite hacer demasiadas burbujas.
Transfiera las celdas re-suspendidas a un matraz T75 por una pipeta. Utilice una pipeta para añadir un medio MEM alfa completo al matraz para alcanzar un volumen total de 10 mililitros con la concentración final de 13.000 células por centímetro cuadrado. Coloque el matraz en la incubadora y escrésquelo a 37 grados con un 5% de dióxido de carbono.
Cambie el medio cada tres días. Observar y monitorear las células bajo un microscopio al cambiar el medio hasta que las células se cultivaron al 100% de confluencia. Preparación del medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares.
Vierta 15 mililitros completos de medio MEM alfa en un tubo estéril de 15 mililitros. Añadir seis microlitro de ácido ascórbico en un medio de 15 mililitros a la concentración final de 4,4 microgramos por mililitro. Mezclar suavemente invirtiendo hacia arriba y hacia abajo.
Formación de láminas celulares mediante cultivo en medio de estimulación. Deseche cuidadosamente el medio alfa MEM completo no normal. Evite tocar las celdas unidas a la parte inferior del matraz.
Añadir 10 mililitros de medio de estimulación lentamente. Evite causar cualquier perturbación a las células completamente confluentes. Cultivo de las células en medio de estimulación durante nueve días y cambiar el medio cada tres días para generar suficientemente hoja celular a 37 grados con 5% de dióxido de carbono.
Preparación de la construcción de células STEM del tendón 3D. Saque el matraz de la incubadora. Deseche completamente el medio de estimulación.
Lave la lámina de celda monocapa con PBS girando el matraz. Desechar el PBS completamente. Utilice una pipeta para añadir un mililitro, 0,25% de trippsina a la esquina del matraz.
Toque la esquina del matraz para separar la hoja de celda monocapa hasta que la esquina de la hoja de celda se lave de la parte inferior del matraz. Añadir inmediatamente un medio MEM alfa completo de nueve mililitros para detener la reacción de la trippsinación. Continúe girando el matraz para despegar completamente la lámina de celda monocapa.
Vierta el total para fijar la hoja de la celda en el plato de Petri con un medio. Utilice una pinza estéril para recoger una esquina de la hoja de celda y gire en el sentido de las agujas del reloj durante 15 veces. Recoja otro extremo de la hoja celular y gire en sentido antihorario durante 10 veces para formular una construcción in vitro similar a un tendón.
Montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial en un biorreactor de diseño único. Conecte los ganchos por el conector y, a continuación, ajuste a dos centímetros entre dos ganchos. Enrolle suavemente la construcción de los TDSC 3D en el gancho de demostración tres veces en cada gancho.
Fije los ganchos con la construcción de la célula en la cámara del biorreactor apretando los tornillos en dos extremos. Llene la cámara con el medio MEM alfa completo. Conecte el acelerador a la cámara de cultivo por cable.
Corte el conector de los ganchos con pinzas estériles. Encienda el controlador de alimentación y canal para iniciar una estimulación mecánica. Coloque la tapa de la cámara, rastree las luces indicadoras y asegúrese de que el biorreactor pueda funcionar correctamente.
Coloque el biorreactor en la incubadora y someta la construcción de la célula 3D al estiramiento mecánico. El régimen de carga es 6% de deformación, 0,25 hercios de frecuencia, ocho horas seguidas de 16 horas de descanso durante seis días. Evaluación del tejido mecánico estimulado in vitro tipo tendón.
Afloje los tornillos con un destornillador y retire el conjunto con cuidado. Ponga el tejido similar al tendón en 4%PFA para fijación durante 15 minutos, Coloque el tejido similar al tendón fijo en un casete de biopsia con biopsia de mascotas. Proceso para deshidratar una muestra.
Y finalmente, evaluar por la EH posición histológica. Repita todo el protocolo y extraiga el ARN del tejido similar al tendón para evaluar la expresión de marcadores tenogénicos por qPCR. Antes de la estimulación mecánica, los TDSC crecerán al 100% de confluencia en un medio completo y mostrarán una morfología estructural exterior desorganizada.
Después de seis días vio el estiramiento, la carga mecánica, la matriz celular adicional y las alineaciones celulares estaban bien orientadas. Las células estaban bien pobladas y bien envueltas en ECM después de la carga mecánica. La morfología celular se presentó para ser local y era más similar a las células del tendón normal en comparación con la que tenía sin estirarse.
La densidad celular en la construcción de celdas con carga era mayor que la que no se cargaba. los resultados de qPCR mostraron que los asuntos actuales aumentaron la expresión de marcadores tenogénicos, incluyendo escleraxis, Mohawk, tenomolina y colágeno tipo 1 en comparación con los tratados por la cultura declarada. En términos de sistema de biorreactor de estimulación mecánica, se utilizó cámara separada con motor lineal en nuestro protocolo actual.
Debido a que puede proporcionar una carga mecánica precisa y es portátil y fácil de ajustar en comparación con las formas en que la hoja de células 2D tradicional y el estiramiento biaxial, la construcción de la célula 3D es más similar a la forma real del tendón. Y el estiramiento uniaxial es más similar a las características de las fortalezas de las células del tendón. Esto proporciona una base teórica del uso del sistema estirado uniaxial 3D para estimular la diferenciación de las ETSC.
Por lo tanto, la hoja celular 2D finalmente se enrutaba a una construcción de celda 3D y se sometía a uniaxial en el protocolo actual. Según nuestro sistema de biorreactor, nuestro régimen de carga es 6% de tensión, 0,25 Hertz frecuencia, ocho horas seguidas de 16 horas de descanso durante seis días. Por último, la eficacia del protocolo se demostró mediante la morfología y el nivel de expresión de los marcadores tenogénicos.
Todo el proceso de operación es simple, pero el operador necesita ser prestar atención para mantener el entorno de TDSC esterilizado en todo momento. Hay muchas aplicaciones de nuestro protocolo. El proceso de estimular los TDSC para imitar la diferenciación in vivo es útil para la investigación del proceso patológico de tendinopatía.
Además, este protocolo proporciona un método reproducible para la diferenciación dirigida de los TDSC en tejido similar a un tendón. Por lo que se puede utilizar de forma sencilla y eficaz para la cultura de tendones de ingeniería potencial. En resumen, la aplicación de un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial 3D es simple, económico, reproducible y un método válido para inducir la diferenciación tenogénica de las ETDS.
Nuestro protocolo proporciona todo el proceso en detalle.
