Farklı mekanik yükleme parametreleri tendon kaynaklı KÖK hücreleri farklı hücrelere farklı olarak neden olabilir. Bu üç boyutlu tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemini, tendon kaynaklı KÖK hücrelerin tenojenik farklılaşmasını sağlamak için ayrıntılı bir şekilde uygulama süreci başlatıyoruz. Tendinopati ortopedi bölümünde sık görülen spor yaralanmalarından biridir.
Aşil tendinopati varlığı orta ve uzun mesafe koşucuları için% 29'a kadar en sık görülür, patella tendinopati varlığı voleybol sporcular da yüksek iken, basketbol, atletizm, hentbol, ve futbol. Ancak, tendon sınırlı kendi kendine iyileşme yeteneği ve etkili tedavi eksikliği nedeniyle, tendinopati hala hastaların yaşam kalitesi üzerinde önemli olumsuz etkisi vardır. Tendon hücrelerinin önemli öncü hücreleri olarak TDSC olarak bilinen tendon türetilmiş KÖK hücreler, tendinopati gelişiminde önemli bir rol oynar, ayrıca tendinopati sonrası fonksiyonel ve yapısal restorasyon.
Ancak yükleme gerilimi, yükleme sıklığı, yükleme türü ve yükleme süresi gibi mekanik yükleme parametrelerinden farklı olarak TDSC'lerin farklı hücrelere farklılaşmasına neden olabilir. Bu nedenle, etkili ve geçerli bir mekanik yükleme rejimi tendon oluşumu için çok önemlidir. Mevcut protokolün, fare TDSC'lerinin izolasyonu, fare TDSC'lerinin kültür ve genişlemesi, hücre tabakasının oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması, stimülasyon ortamında kültüredilerek hücre sayfası oluşumu, 3D tendon KÖK hücre yapısının hazırlanması, mekanik stimülasyon kompleksini esneten tek eksenli hücrelerin biraraya edilmesi ve vitro tendon benzeri dokularda uyarılan mekanik uyarılmış mekanik değerlendirilmesi gibi yedi aşaması vardır.
Fare lerin izolasyonu TDSC'ler. Servikal çıkış nedeniyle altı ila sekiz haftalık farelerde kullanılır. Hasat patella tendonu ve Aşil tendonu.
Üç saat boyunca altı mililitre Tip 1 kollajenaz ile tendon sindirin. Yedi gün boyunca FBS% 10 ve streptomisin ve penisilin karışımı% 1 içeren tam alfa MEM hücreleri ve kültür toplayın. akış sitometrisine göre floresan aktif hücre sıralaması, CD44, CD90 ve Sca-1 dahil olmak üzere hücre yüzey ibelirteçlerinin ekspresyonu kullanarak TDSC'leri tanımlayın.
CD34 ve CD45 ifadesini kapalı eksikliği. Hücreleri geçiş ve dondurma. Pasajlı hücreler daha sonraki adımlar için kullanılacaktır.
Kültür ve fareler TDSCs genişlemesi. Isınmış fare tendon KÖK hücreleri alın. Yavaş yavaş tam alfa MEM ekstra dört ila beş mililitre ekleyin.
Karışımı bir pipetle 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir pipet ile toplam sekiz mililitre orta ile top up. Tüp bir kuyu dengesi santrifüj içine yerleştirin.
Santrifüj hücreleri 347 g'da 5 dakika. Santrifüjden bir tüp çıkar. Alttaki peleti kontrol et.
Serbest ortamı dekant. Hücreleri bir ila iki mililitrelik tam ortamda yavaşça askıya alın. Çok fazla kabarcık lar yapmaktan kaçının.
Yeniden askıya alınan hücreleri bir pipetle T75 şişesine aktarın. Santimetre kare başına 13,000 hücre son konsantrasyonu ile 10 mililitre toplam hacmine ulaşmak için şişe ye tam alfa MEM orta eklemek için bir pipet kullanın. Şişeyi kuvöze yerleştirin ve %5 karbondioksitle 37 derecede kültüredin.
Ortamı her üç günde bir değiştirin. Hücreler %100 biraraya gelene kadar ortamı değiştirirken hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve izleyin. Hücre sayfası oluşumu için stimülasyon kültür ortamının hazırlanması.
15 mililitrelik steril bir tüp içine 15 mililitre tam alfa MEM ortamı dökün. Mililitre başına 4,4 mikrogram son konsantrasyona 15 mililitre lik ortama altı mikrolitre askorbik asit ekleyin. Yukarı ve aşağı ters çevirerek yavaşça karıştırın.
Stimülasyon ortamında kültüredilerek hücre tabakasının oluşumu. Normal olmayan tam alfa MEM ortamını dikkatlice atın. Şişenin altına bağlı hücrelere dokunmaktan kaçının.
Yavaş yavaş 10 mililitre stimülasyon orta ekleyin. Tam olarak etkili hücrelerde herhangi bir rahatsızlık neden kaçının. Kültür dokuz gün boyunca stimülasyon orta hücreleri ve yeterli karbondioksit% 5 ile 37 derece hücre levha oluşturmak için her üç günde bir orta değiştirin.
3D tendon KÖK hücre yapısının hazırlanması. Şişeyi kuvözden çıkar. Stimülasyon ortamını tamamen atın.
Tek katmanlı hücre sayfasını şişeyi döndürerek PBS ile yıkayın. PBS'yi tamamen atın. Şişenin köşesine bir mililitre, %0,25 tripsin eklemek için pipet kullanın.
Hücre sayfasının köşesi şişenin alt kısmından yıkayana kadar tek katmanlı hücre sayfasını ayırmak için şişenin köşesine dokunun. Hemen tripsinizasyon reaksiyonu durdurmak için dokuz mililitre tam alfa MEM orta ekleyin. Tamamen monolayer hücre levha soymak için şişe girdap devam edin.
Orta ile Petri kabına hücre levha eklemek için toplam dökün. Hücre sayfasının bir köşesini almak ve 15 kez saat yönünde döndürmek için steril bir cızırtıcı kullanın. Hücre sayfasının başka bir ucunu seçin ve tendon benzeri bir in vitro yapı oluşturmak için 10 kez saat yönünün tersine döndürün.
Benzersiz tasarlanmış biyoreaktör de tek eksenli germe mekanik stimülasyon kompleksinin montajı. Kancaları konektörle bağlayın ve iki kanca arasında iki santimetreye ayarlayın. 3D TDSC'leri her kancada üç kez demo kancası üzerinde inşa edin.
İki uçtaki vidaları sıkarak kancaları biyoreaktör odasına hücre yapısıile sabitle. Odayı tam alfa MEM ortamı ile doldurun. Hızlandırıcıyı kabloile kültür odasına bağlayın.
Kancaların konektörünü steril cımbızla kesin. Mekanik bir uyarımı başlatmak için güç ve kanal denetleyicisini açın. Kapağı odaya koyun, gösterge ışıklarını takip edin ve biyoreaktörün düzgün çalışabildiğinden emin olun.
Biyoreaktörü kuvöze koyun ve 3D hücre yapısını mekanik germeye tabi edin. Yükleme rejimi% 6 zorlanma, 0.25 Hertz frekans, sekiz saat altı gün boyunca 16 saat dinlenme takip. Mekanik uyarılmış in vitro tendon benzeri dokunun değerlendirilmesi.
vidaları bir tornavida ile gevşetin ve montajı dikkatlice çıkarın. 15 dakika fiksasyon için% 4 PFA içine tendon benzeri doku koyun, evcil hayvanların biyopsi ile bir biyopsi kaset içine sabit tendon benzeri doku yerleştirin. Bir numuneyi susuz katmak için işlem.
Ve son olarak, HD histolojik duruş tarafından değerlendirin. Tüm protokolü tekrarlayın ve tenojenik belirteçlerin qPCR ile ekspresyonunu değerlendirmek için tendon benzeri dokudan RNA ayıklayın. Mekanik stimülasyon dan önce, TDSC'ler tam ortamda %100 biraraya gelecek ve düzensiz bir dışyapısal morfoloji sergileyecekler.
Altı gün sonra germe, mekanik yükleme, ekstra hücresel matris ve hücre hizalamaiyi gördün. Hücreler iyi doldurulur ve mekanik yükleme den sonra ECM'de iyi zarflanmış. Hücre morfolojisi tespit edildi ve germe olmadan bir göre normal tendon hücrelerine daha benzerdi.
Yükleme ile hücre yapısındaki hücre yoğunluğu, yükleme yapılmadan olandan daha yüksekti. qPCR sonuçları, mevcut konuların skleraxis, Mohawk, tenomodulin ve Tip 1 kollajen gibi tenojenik belirteçlerin ekspresyonunu, belirtilen kültür tarafından tedavi edilenlere göre artırdığını göstermiştir. Bu protokolde mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi açısından lineer motorlu ayrılmış oda kullanılmıştır.
Doğru mekanik yükleme sağlayabilir ve taşınabilir ve kolay geleneksel 2B hücre levha ve biaksiyel streç yolları ile karşılaştırıldığında ayarlanabilir olduğundan, 3D hücre yapısı tendon gerçek şekline daha benzer. Ve tek eksenli streç tendon hücrelerinin güçlü özelliklerine daha benzer. Bu TDSCs farklılaşmasını uyarmak için 3D uniaxial gerilmiş sistemi kullanarak teorik bir temel sağlar.
Böylece, 2D hücre sayfası nihayet bir 3D hücre yapısına yönlendirildi ve mevcut protokolde tek taraflı olarak uygulandı. Biyoreaktör sistemimize göre yükleme rejimimiz %6 gerinim, 0.25 Hertz frekansı ve ardından sekiz saat ve ardından altı gün boyunca 16 saat istirahat. Son olarak, protokolün etkinliği morfoloji ve tenojenik belirteçlerin ifade düzeyi ile gösterilmiştir.
Tüm işlem süreci basittir, ancak operatör tdsc ortamıher zaman sterilize tutmak için dikkat etmek gerekir. Protokolümüzün birçok uygulaması var. TDSC'leri in vivo farklılaşmayı taklit etmek için uyarma süreci, tendinopatinin patolojik sürecinin araştırılmasında yararlıdır.
Ayrıca, bu protokol tendon benzeri doku içine TDSC'lerin yönlendirilmiş farklılaşması için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yüzden basit ve etkili bir şekilde potansiyel mühendislik tendon kültürü için kullanılabilir. Özetle, 3D tek eksenli mekanik stimülasyon biyoreaktör sistemi uygulamak basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve TDSC'lerin tenojenik farklılaşmasını sağlamak için geçerli bir yöntemdir.
Protokolümüz tüm süreci ayrıntılı olarak sağlar.
