異なる機械的負荷パラメータは、異なる細胞に分化された腱由来のSTEM細胞を誘導する可能性があります。腱由来のSTEM細胞の発熱性分化を誘導するために、この三次元単軸機械的刺激バイオリアクターシステムを適用する詳細なプロセスを紹介する。腱障害は、整形外科で一般的なスポーツ傷害の一つです。
アキレス腱症の存在は、中長距離ランナーの場合は最大29%で最も一般的ですが、バレーボール、バスケットボール、陸上競技、ハンドボール、サッカーのアスリートでも膝蓋腱症の存在が高いです。しかし、腱の自己治癒能力が限られており、効果的な治療が欠如しているため、腱障害は依然として患者の生活の質に重大な悪影響を及ぼす。腱細胞の重要な前駆細胞としてTDCとして知られている腱由来のSTEM細胞は、腱障害の発症だけでなく、腱障害後の機能および構造修復において重要な役割を果たす。
ただし、荷重応力、荷重頻度、荷重タイプ、ローディング期間など、機械的荷重パラメータとは異なり、TDSC が異なるセルに分化される可能性があります。したがって、効果的かつ有効な機械的負荷のレジームは腱の起源にとって非常に重要である。本プロトコルの7段階は、マウスTDSCの単離、マウスTDSCの培養および拡大、細胞シート形成のための刺激培養培地の調製、刺激媒体中での培養による細胞シート形成、3D腱幹細胞構築の調製、機械的刺激を伸ばす単軸細胞の組立、および機械的刺激体腱様組織の評価を含む。
マウスの分離 TDC. 子宮頸部脱臼により生後6~8週齢のマウスで使用される。収穫膝蓋腱とアキレス腱。
6ミリリットル1型コラゲターゼで3時間消化腱。細胞を収集し、7日間FBSの10%とストレプトマイシンとペニシリン混合物の1%を含む完全なアルファMEMでそれを培養します。フローサイトメトリーによる蛍光活性化細胞選別、CD44、CD90、およびSca-1を含む細胞表面マーカーの発現を使用してTDSCを識別する。
CD34 と CD45 の表現が不足しています。通過し、細胞を凍結します。通路セルは、さらなるステップのために使用されます。
マウスTDSCの培養と拡大。温めたマウス腱幹細胞を採取する。ゆっくりと完全なアルファMEMの余分な4〜5ミリリットルを追加します。
ピペットで15ミリリットルの遠心分離管に混合物を移す。ピペットで合計8ミリリットルに培地でトップアップ。チューブを遠心分離機にバランスよく入れ、
遠心分離細胞は347gで5分間行う。遠心分離機からチューブを取り出します。下部のペレットを確認します。
フリーメディアをデカントします。1~2ミリリットルの完全培地で細胞を穏やかに再中断する。あまりにも多くの泡を作ることを避けてください。
再懸濁した細胞をピペットでT75フラスコに移す。ピペットを使用してフラスコに完全なアルファMEM培地を加え、1平方センチメートルあたり13,000細胞の最終濃度で10ミリリットルの総体積に達します。フラスコをインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素で37度で培養します。
3 日ごとにメディアを変更します。培地を100%合流まで培養するまで、顕微鏡下で細胞を観察し、監視します。細胞シート形成のための刺激培養培地の調製。
15ミリリットルの無菌チューブに15ミリリットルの完全なアルファMEM培地を注ぎます。15ミリリットルの培地に6マイクロリットルのアスコルビン酸を加え、1ミリリットル当たり4.4マイクログラムの最終濃度にします。上下に反転してやさしく混ぜます。
刺激媒体で培養することにより細胞シート形成する。非正規の完全なアルファMEM媒体を慎重に廃棄してください。フラスコの底部に付着した細胞に触れないようにしてください。
10ミリリットルの刺激媒体をゆっくりと加えます。完全にコンフルな細胞に任意の妨害を引き起こすのを避けます.細胞を刺激培地で9日間培養し、3日ごとに培地を変えて、5%の二酸化炭素で37度の細胞シートを十分に生成した。
3D腱幹細胞構築物の調製インキュベーターからフラスコを取り出します。刺激媒体を完全に廃棄する。
フラスコを渦巻いて単層セルシートをPBSで洗浄する。PBS を完全に破棄します。ピペットを使用して、フラスコの隅に1ミリリットル、0.25%トリプシンを加えます。
フラスコの角をタップして、単層セルシートの角がフラスコの底面から打ち出されるまで、単層セルシートを取り外します。すぐにトリプシン化の反応を停止するために9ミリリットル完全なアルファMEM培地を追加します。フラスコを旋回し、単層細胞シートを完全に剥がします。
合計を注ぎ、セルシートをペトリ皿に媒体で取り付けます。滅菌用のツイーザーを使用してセルシートの片隅を拾い上げ、時計回りに15回回転させます。細胞シートの別の端を拾い、腱のようなインビトロ構造を定式化するために10回反時計回りの方向に回転させます。
ユニークな設計されたバイオリアクターにおける単軸伸縮機械刺激複合体の組み立て。コネクタでフックを接続し、2つのフックの間に2センチメートル調整します。デモフックの3D TDSCコンストラクトを各フックで3回そっと巻きます。
両端のネジを締めて、細胞コンストラクトをバイオリアクターのチャンバーに固定します。完全なアルファMEM媒体でチャンバーを満たします。ケーブルで、アクセラレータを培養チャンバーに接続します。
無菌ピンセットでフックのコネクタをカットします。電源とチャネルコントローラの電源を入れ、機械的刺激を開始します。チャンバーに蓋をして、インジケータライトを追跡し、バイオリアクターが正常に機能できることを保証します。
インキュベーターにバイオリアクターを入れ、3D細胞構築物を機械的ストレッチに供する。負荷体制は6%株、0.25ヘルツ周波数、8時間、その後6日間16時間の休息です。機械的刺激体のインビトロ腱様組織の評価
スクリュードライバーでねじを緩め、慎重にアセンブリを取り外します。腱様組織を4%PFAに入れて15分間固定し、固定された腱様組織をペットからの生検を伴う生検カセットに入れます。サンプルを脱水処理する。
そして最後に、HD組織学的立場で評価する。qPCRによるテノゲンマーカーの発現を評価するために、プロトコル全体を繰り返し、腱様組織からRNAを抽出する。機械的刺激の前に、TDSCは完全な媒体で100%合流まで成長し、組織化されていない外向きの構造形態を表示します。
6日後、ストレッチ、機械的ローディング、余分な細胞マトリックス、および細胞の配置が十分に向き合いました。細胞は、機械的な負荷の後にECMによく入り込み、よく包まれました。細胞形態は、見つけるために提示され、ストレッチをしていない細胞と比較して正常な腱細胞に似ていた。
ローディングを伴うセル構成体の細胞密度は、ローディングなしのものよりも高かった。qPCRの結果は、本件が、記載された培養物と比較して、スクラシス、モヒカン、テノモジュリン、および1型コラーゲンを含むテノジェニックマーカーの発現を増加させたことを示した。機械的刺激バイオリアクターシステムの観点から、線形モータで分離されたチャンバーが本プロトコルに使用された。
それは正確な機械負荷を提供することができ、従来の2D細胞シートと二軸ストレッチの方法と比較してポータブルで簡単に調整することができるので、3D細胞構造は腱の実際の形状に似ています。そして、単軸ストレッチは腱細胞の強みの特性に似ています。これは、TDCの分化を刺激するために3D単軸伸伸システムを使用する理論的根拠を提供します。
このように、2Dセルシートは最終的に3D細胞構造にルーティングされ、本プロトコルで単軸を受けた。私たちのバイオリアクターシステムによると、私たちの負荷体制は6%株、0.25ヘルツ周波数、8時間、その後6日間16時間の休息です。最後に、プロトコルの有効性は、形態学および形質マーカーの発現レベルによって実証された。
全体の操作プロセスは簡単ですが、オペレータは常にTDSCの環境を殺菌保つために注意を払う必要があります。プロトコルには多くのアプリケーションがあります。TDSCを刺激して生体内での分化を模倣するプロセスは、腱障害の病理学的プロセスの調査に役立つ。
また、このプロトコルは、TDcの腱様組織への指向的な分化のための再現可能な方法を提供する。そのため、潜在的な設計された腱培養に対して、簡単かつ効果的に使用できます。要約すると、3D単軸の機械的刺激バイオリアクターシステムを適用することは、簡便で経済的で、再現性があり、TDCのテノゲン分化を誘導する有効な方法である。
私たちのプロトコルは、詳細に全体のプロセスを提供します。
