פרמטרי טעינה מכניים שונים עלולים לגרום לתאי STEM הנגזרים מגידים להבדיל לתאים שונים. אנו מציגים תהליך מפורט של החלת מערכת ביו-ריאקטור גירוי מכני תלת מימדי זה כדי לגרום בידול טנוגני של תאי STEM שמקורם בגיד. טנדינופתיה היא אחת מפציעות הספורט הנפוצות במחלקה האורתופדית.
הנוכחות של נטיות אכילס שכיחה ביותר עם עד 29% עבור רצים באמצע ובזמן רב, בעוד הנוכחות של נטינופתיה פתלה הוא גם גבוה ספורטאים של כדורעף, כדורסל, מסלול ומגרש, כדוריד, וכדורגל. עם זאת, בשל יכולת ריפוי עצמית מוגבלת של גיד וחוסר טיפול יעיל, גיד עדיין יש השפעה שלילית משמעותית על איכות החיים של חולים. תאי STEM שמקורם בגיד, הידועים בשם TDSCs כתאי מבשר חשובים של תאי גידים, ממלאים תפקיד חשוב בהתפתחות נטינופתיה, כמו גם בשיקום התפקודי והמבני שלהם לאחר גידים.
עם זאת שונה פרמטרי טעינה מכניים, כגון עומס מתח, תדירות טעינה, סוג טעינה, ות תקופת טעינה יכול לגרום TDSCs להבדיל לתאים שונים. לכן, משטר טעינה מכני יעיל ותקף הוא משמעותי מאוד עבור בראשית הגיד. ישנם שבעה שלבים של הפרוטוקול הנוכחי, כולל בידוד של עכברים TDSCs, תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs, הכנת תרבות גירוי בינוני להיווצרות גיליון התא, היווצרות גיליון התא על ידי culturing בינוני גירוי, הכנת מבנה תאי STEM גיד 3D, הרכבה של תאים יוניאקסיאליים מתיחת קומפלקס גירוי מכני, והערכת מכני מגורה ברקמה דמוית גיד גידים.
בידוד של עכברים TDSCs. משמש בעכברים כי הם שישה עד שמונה שבועות עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם. גידים פאטלה קציר וגידים אכילס.
לעכל גיד עם שישה מיליליטר סוג 1 קולגן במשך שלוש שעות. לאסוף את התאים ולתרבות אותו MEM אלפא מלא המכיל 10% של FBS ו 1% של תערובת סטרפטומיצין ופניסילין במשך שבעה ימים. זהה TDSCs באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות לפי ציטומטריית זרימה, ביטוי של סמני משטח תאים, כולל CD44, CD90 ו- Sca-1.
אין את הביטוי של CD34 ו- CD45. מעבר והקפאת תאים. תאים מעבר ישמשו לצעדים נוספים.
תרבות והתרחבות של עכברים TDSCs. קח את העכברים מחוממים גיד תאי STEM. לאט להוסיף עוד ארבעה עד חמישה מיליליטר של MEM אלפא מלא.
מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר על ידי פיפטה. למעלה עם בינוני עד 8 מיליליטר בסך הכל על ידי פיפטה. מניחים את הצינור לתוך צנטריפוגה איזון טוב.
תאי צנטריפוגה ב 347 גרם במשך חמש דקות. תוציא צינור מהצנטריפוגה. תבדוק את הכדור בתחתית.
דקאנט המדיום החופשי. השהה מחדש תאים בעדינות במדיום שלם של מיליליטר עד אחד עד שני מיליליטר. הימנע עושה בועות רבות מדי.
העבר תאים מושעים מחדש לבקבוק T75 על-ידי פיפטה. השתמש פיפטה להוסיף מלא אלפא MEM בינוני לבקבוק כדי להגיע לנפח כולל של 10 מיליליטר עם הריכוז הסופי של 13, 000 תאים לס"מ מרובע. מניחים את הבקבוק באינקובטור ומתרבים אותו ב-37 מעלות עם 5% פחמן דו חמצני.
שנה את המדיום כל שלושה ימים. התבונן ונטר את התאים תחת מיקרוסקופ בעת שינוי המדיום עד שתאים תותבו ל- 100%confluence. הכנת תרבות גירוי בינוני להיווצרות יריעות תאים.
יוצקים 15 מיליליטר להשלים את מדיום אלפא MEM לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר. מוסיפים שש חומצה אסקורבית מיקרוליטר לתוך 15 מיליליטר בינוני לריכוז הסופי של 4.4 מיקרוגרם למיליליטר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך למעלה ולמטה.
היווצרות גיליון תאים על ידי culturing במדיום גירוי. השלך בזהירות מדיום אלפא MEM שלם לא רגיל. הימנע מנגיעה בתאים המחוברים לתחתית הבקבוק.
מוסיפים 10 מיליליטר גירוי בינוני לאט. הימנע מגרימת הפרעה לתאים המבלבלים לחלוטין. תרבו את התאים במדיום הגירוי במשך תשעה ימים ושנה את המדיום כל שלושה ימים כדי ליצור מספיק גיליון תאים ב 37 מעלות עם 5% של פחמן דו חמצני.
הכנת מבנה תאי STEM גיד 3D. תוציא את הבקבוק מהאס אינקובטור. השלך את מדיום הגירוי לחלוטין.
לשטוף את גיליון תא monolayer עם PBS על ידי מערבולת הבקבוק. השלך את PBS לחלוטין. השתמש פיפטה כדי להוסיף מיליליטר אחד, 0.25% טריפסין לפינת הבקבוק.
הקש על הפינה של הבקבוק כדי לנתק את גיליון התא monolayer עד הפינה של גיליון התא שוטף את החלק התחתון של הבקבוק. מיד להוסיף תשעה מיליליטר להשלים אלפא MEM בינוני כדי לעצור את התגובה של טריפסיניזציה. המשך מערבל את הבקבוק כדי לקלף לחלוטין את גיליון התא monolayer.
יוצקים את הסכום הכולל כדי לחבר את גיליון התא לתוך צלחת פטרי עם בינוני. השתמש בפינצטה סטרילית כדי להרים פינה אחת של גיליון התא ולסובב בכיוון השעון במשך 15 פעמים. להרים קצה אחר של גיליון התא ולסובב בכיוון נגד כיוון השעון במשך 10 פעמים כדי לנסח מבנה במבחנה דמוי גיד.
הרכבה של קומפלקס גירוי מכני מתיחה uniaxial ב bioreactor מעוצב ייחודי. חבר את הקרסים על-ידי המחבר ולאחר מכן התאם לשני סנטימטרים בין שני ווים. בעדינות רוח TDSCs 3D לבנות על וו הדגמה במשך שלוש פעמים על כל וו.
אבטח את הקרסים עם מבנה התא על תא הביוריקטור על ידי הידוק הברגים בשני קצוות. מלאו את התא במדיום אלפא MEM מלא. חבר את המאיץ לתא התרבות באמצעות כבל.
חותכים את מחבר הקרסים על-ידי פינצטה סטרילית. הפעל את בקר החשמל והתעלה כדי להתחיל גירוי מכני. שים את המכסה על התא, לעקוב אחר נוריות החיווי, ולהבטיח bioreactor יכול לתפקד כראוי.
שים את bioreactor באינקובטור ולחשוף את מבנה התא 3D מתיחה מכנית. משטר ההעמסה הוא 6% זן, תדר הרץ 0.25, שמונה שעות ואחריו מנוחה של 16 שעות במשך שישה ימים. הערכה של רקמה מכנית מגורה במבחנה דמויי גיד.
לשחרר את הברגים על ידי מברג ולהוריד את ההרכבה בזהירות. מכניסים את הרקמה דמוית הגיד ל-4%PFA למשך 15 דקות, מכניסים את הרקמה הקבועה דמוית הגיד לקלטת ביופסיה עם ביופסיה של חיות מחמד. תהליך לייבש דגימה.
ולבסוף, להעריך על ידי מעמד היסטולוגי HD. חזור על כל הפרוטוקול ולחלץ RNA מן הרקמה דמוית הגיד להערכת הביטוי של סמנים tenogenic על ידי qPCR. לפני גירוי מכני, TDSCs יגדלו ל 100% confluence במדיום מלא ולהציג מורפולוגיה מבנית לא מאורגנת כלפי חוץ.
לאחר שישה ימים ראית מתיחות, טעינה מכנית, מטריצה תאית נוספת ויישורי התאים היו אוריינטציה טובה. התאים היו מאוכלסים היטב ועטפו היטב ב- ECM לאחר טעינה מכנית. מורפולוגיה של התא הוצגה להיות ממוקם והיה דומה יותר לתאי גידים נורמליים בהשוואה לזה עם ללא מתיחה.
צפיפות התאים בבניית תאים עם טעינה הייתה גבוהה יותר מהצפיפות ללא טעינה. תוצאות qPCR הראו כי הנושאים הנוכחיים הגדילו את הביטוי של סמנים tenogenic, כולל scleraxis, מוהוק, tenomodulin, ו קולגן מסוג 1 לעומת אלה שטופלו על ידי התרבות המוצהרת. במונחים של מערכת bioreactor גירוי מכני, תא מופרד עם מנוע ליניארי שימש בפרוטוקול הנוכחי שלנו.
מכיוון שהוא יכול לספק טעינה מכנית מדויקת והוא נייד וקל לתנוכה בהשוואה לאופן שבו גיליון התאים הדו-מימדי המסורתי והמתיחה הדו-מרחבית, מבנה התאים תלת-מימדיים דומה יותר לצורה האמיתית של הגיד. והמתיחה יוניאקסיאלית דומה יותר למאפייני החוזקות של תאי הגיד. זה מספק בסיס תיאורטי של שימוש במערכת 3D uniaxial מתוח כדי לעורר את ההידול של TDSCs.
לפיכך, גיליון תא דו-מימדי נותב לבסוף לתוך מבנה תא תלת-מימדי ועבר ניתוח חד-קרן בפרוטוקול הנוכחי. על פי מערכת הביו-ריאה שלנו, משטר הטעינה שלנו הוא 6% זן, תדר הרץ 0.25, שמונה שעות ואחריו מנוחה של 16 שעות במשך שישה ימים. לבסוף, האפקטיביות של הפרוטוקול הוכח על ידי מורפולוגיה ואת רמת הביטוי של סמנים tenogenic.
תהליך הפעולה כולו הוא פשוט, אבל המפעיל צריך להיות שם לב כדי לשמור על הסביבה של TDSC מעוקר בכל עת. ישנם יישומים רבים של הפרוטוקול שלנו. התהליך של גירוי TDSCs לחקות התברואה ב vivo הוא מועיל לחקירה של תהליך פתולוגי של גידים.
חוץ מזה, פרוטוקול זה מספק שיטה לשחזור עבור בידול מכוון של TDSCs לתוך רקמה דמוית גיד. אז זה יכול לשמש בפשטות וביעילות עבור תרבות גידים מהונדסים פוטנציאליים. לסיכום, החלת מערכת ביוריאקטור גירוי מכני Uniaxial 3D היא פשוטה, כלכלית, ניתנת לשחזור, ושיטה תקפה כדי לגרום בידול tenogenic של TDSCs.
הפרוטוקול שלנו מספק את כל התהליך בפרטים.
