Diferentes parâmetros de carregamento mecânico poderiam induzir células STEM derivadas do tendão diferenciadas em diferentes células. Introduzimos um processo detalhado de aplicação deste sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica das células STEM derivadas do tendão. Tendinopatia é uma das lesões esportivas comuns no departamento ortopédico.
A presença da tendinopatia de Aquiles é mais comum com até 29% para corredores de média e longa distância, enquanto a presença de tendinopatia patelar também é alta em atletas de vôlei, basquete, atletismo, handebol e futebol. No entanto, devido à limitada capacidade de auto-cura do tendão e à falta de tratamento eficaz, a tendinopatia ainda tem efeito adverso significativo na qualidade de vida dos pacientes. As células STEM derivadas do tendão, conhecidas como TDSCs como as importantes células precursoras das células tendões, desempenham um papel importante no desenvolvimento da tendinopatia, bem como sua restauração funcional e estrutural após a tendinopatia.
Por mais diferentes que os parâmetros de carregamento mecânicos, como estresse de carga, frequência de carga, tipo de carga e período de carregamento podem induzir TDSCs diferenciando-se em diferentes células. Assim, um regime de carregamento mecânico eficaz e válido é muito significativo para a gênese do tendão. São sete etapas do presente protocolo, incluindo isolamento de TDSCs camundongos, cultura e expansão de TDSCs de camundongos, preparação de cultura de estimulação para formação de folhas de células, formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação, preparação de construção de células STEM tendão 3D, montagem das células unixiais que alongam complexo de estimulação mecânica e avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro como tendão.
Isolamento de camundongos TDSCs. Usados em camundongos que têm de seis a oito semanas de idade por deslocamento cervical. Colher tendões de patela e tendões de Aquiles.
Digestão tendão com seis mililitros tipo 1 colagenase por três horas. Colete as células e a cultivar em MEM alfa completo contendo 10% de FBS e 1% de mistura de estreptomicin e penicilina por sete dias. identificar TDSCs usando fluorescência ativada de células por citometria de fluxo, expressão de marcadores de superfície celular, incluindo CD44, CD90 e Sca-1.
Falta a expressão de CD34 e CD45. Passagem e células congelantes. As células com passagem serão usadas para mais passos.
Cultura e expansão de TDSCs de camundongos. Pegue as células STEM do tendão dos ratos aquecidos. Adicione lentamente quatro a cinco mililitros de MEM alfa completo.
Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mililitros por uma pipeta. Cubra com médio a um total de oito mililitros por uma pipeta. Coloque o tubo em centrífuga um bem equilibrado.
Células centrífugas a 347 g por cinco minutos. Tire um tubo da centrífuga. Verifique a pelota na parte inferior.
Decante o meio livre. Suspender as células suavemente em um a dois mililitros meio completo. Evite fazer muitas bolhas.
Transfira células re-suspensas para um frasco T75 por uma pipeta. Use uma pipeta para adicionar meio MEM alfa completo ao frasco para atingir um volume total de 10 mililitros com a concentração final de 13.000 células por centímetro quadrado. Coloque o frasco na incubadora e cultue-o a 37 graus com 5% de dióxido de carbono.
Troque o meio a cada três dias. Observe e monitore as células sob um microscópio ao alterar o meio até que as células fossem cultivadas para 100% de confluência. Preparação do meio de cultura de estimulação para formação de folhas de células.
Despeje 15 mililitros alfa MEM completos em um tubo estéril de 15 mililitros. Adicione seis microliter ácido ascórbico em 15 mililitros médios à concentração final de 4,4 microgramas por mililitro. Misture suavemente invertendo para cima e para baixo.
Formação de folhas de células por cultivo em meio de estimulação. Descarte cuidadosamente o meio MEM alfa completo não normal. Evite tocar nas células presas à parte inferior do frasco.
Adicione 10 mililitros de estimulação lentamente. Evite causar qualquer perturbação às células totalmente confluentes. Cultue as células em meio de estimulação por nove dias e mude o meio a cada três dias para gerar suficientemente folha celular a 37 graus com 5% de dióxido de carbono.
Preparação da construção de células STEM do tendão 3D. Tire o frasco da incubadora. Descarte completamente o meio de estimulação.
Lave a folha de células da monocamada com PBS girando o frasco. Descarte completamente o PBS. Use uma pipeta para adicionar um mililitro, 0,25% trypsin no canto do frasco.
Toque no canto do frasco para desprender a folha de células da monocamada até que o canto da folha de células lave a parte inferior do frasco. Adicione imediatamente nove mililitros alfa mem completo para parar a reação de trippsinização. Continue girando o frasco para descascar completamente a folha de células da monocamada.
Despeje o total para anexar a folha de células na placa de Petri com meio. Use uma pinça estéril para pegar um canto da folha de celular e girar no sentido horário por 15 vezes. Pegue outra extremidade da folha de células e gire em sentido anti-horário por 10 vezes para formular uma construção in vitro semelhante ao tendão.
Montagem do complexo de estimulação mecânica de alongamento uniaxial em bioreator projetado único. Conecte os ganchos pelo conector e ajuste-se a dois centímetros entre dois ganchos. Enrole suavemente os TDSCs 3D construídos sobre o gancho de demonstração por três vezes em cada gancho.
Fixar os ganchos com construção celular na câmara do bioreator apertando os parafusos em duas extremidades. Encha a câmara com o meio MEM alfa completo. Conecte o acelerador à câmara de cultura por cabo.
Corte o conector dos ganchos por pinças estéreis. Ligue o controlador de energia e canal para iniciar uma estimulação mecânica. Coloque a tampa na câmara, rastreie as luzes indicadoras e garanta que o bioreator possa funcionar corretamente.
Coloque o bioreator na incubadora e submia a construção de células 3D ao alongamento mecânico. O regime de carga é de 6%, 0,25 de frequência hertz, oito horas seguidas de 16 horas de descanso durante seis dias. Avaliação do tecido mecânico estimulado in vitro como tendão.
solte os parafusos por uma chave de fenda e retire cuidadosamente o conjunto. Coloque o tecido semelhante ao tendão em 4% PFA para fixação por 15 minutos, coloque o tecido tendão fixo em uma fita biópsia com biópsia de animais de estimação. Processe para desidratar uma amostra.
E, finalmente, avaliar por hd posição histológica. Repita todo o protocolo e extraia RNA do tecido semelhante ao tendão para avaliar a expressão de marcadores tenogênicos por qPCR. Antes da estimulação mecânica, os TDSCs crescerão até 100% de confluência em meio completo e exibirão uma morfologia estrutural externa desorganizada.
Depois de seis dias você viu alongamento, carregamento mecânico, matriz celular extra, e os alinhamentos celulares foram bem orientados. As células estavam bem povoadas e bem envoltas em ECM após o carregamento mecânico. A morfologia celular foi apresentada para ser localizada e foi mais semelhante às células tendinosas normais em comparação com a que tem sem alongamento.
A densidade celular na construção celular com carga era maior do que a sem carga. os resultados da qPCR mostraram que as questões atuais aumentaram a expressão de marcadores tenogênicos, incluindo scleraxis, Mohawk, tenomodulin e colágeno Tipo 1 em comparação com os tratados pela cultura declarada. Em termos de sistema bioreator de estimulação mecânica, câmara separada com motor linear foi utilizada em nosso protocolo atual.
Como ele pode fornecer carregamento mecânico preciso e é portátil e fácil de ser ajustado em comparação com as formas como a folha tradicional de células 2D e o trecho biaxial, a construção de células 3D é mais semelhante à forma real do tendão. E o estiramento uniaxial é mais semelhante às características dos pontos fortes das células tendinosas. Isso fornece uma base teórica do uso do sistema esticado uniaxial 3D para estimular a diferenciação dos TDSCs.
Assim, a folha de células 2D foi finalmente roteada para uma construção de célula 3D e submetida a uniaxial no presente protocolo. De acordo com nosso sistema bioreator, nosso regime de carga é de 6%, 0,25 frequência hertz, oito horas seguidas de 16 horas de descanso por seis dias. Finalmente, a eficácia do protocolo foi demonstrada pela morfologia e pelo nível de expressão dos marcadores tenogênicos.
Todo o processo de operação é simples, mas o operador precisa estar atento para manter o ambiente de TDSC esterilizado o tempo todo. Existem muitas aplicações do nosso protocolo. O processo de estimular os TDSCs a imitar a diferenciação in vivo é útil para a investigação do processo patológico da tendinopatia.
Além disso, este protocolo fornece um método reprodutível para diferenciação direcionada de TDSCs em tecido tendinoso. Assim, pode ser usado de forma simples e eficaz para a cultura potencial do tendão projetado. Em resumo, aplicar um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial 3D é simples, econômico, reproduzível e um método válido para induzir a diferenciação tenogênica dos TDSCs.
Nosso protocolo fornece todo o processo em detalhes.
