Différents paramètres de chargement mécanique pourraient induire des cellules SOUCHES dérivées du tendon différenciées en différentes cellules. Nous introduisons le processus détaillé d’application de ce système uniaxial tridimensionnel de bioréacteur de stimulation mécanique pour induire la différenciation tenogenic des cellules STEM tendon-dérivées. Tendinopathy est l’une des blessures sportives communes dans le département orthopédique.
La présence de tendinopathie d’Achille est plus fréquente avec jusqu’à 29% pour les coureurs de moyenne et longue distance, tandis que la présence de tendinopathy patella est également élevé chez les athlètes de volley-ball, basket-ball, athlétisme, handball, et le football. Cependant, en raison de la capacité limitée d’auto-guérison du tendon et le manque de traitement efficace, tendinopathy a toujours l’effet défavorable significatif sur la qualité de vie des patients. Les cellules SOUCHES dérivées du tendon, connues sous le nom de TDSC comme les cellules précurseurs importantes des cellules tendons, jouent un rôle important dans le développement de la tendinopathie, ainsi que dans leur restauration fonctionnelle et structurale après tendinopathie.
Toutefois, différents des paramètres de chargement mécaniques, tels que le stress de chargement, la fréquence de chargement, le type de chargement et la période de chargement peuvent inciter les TDSC à se différencier en différentes cellules. Ainsi, un régime de chargement mécanique efficace et valide est très important pour la genèse du tendon. Il y a sept étapes du protocole actuel, y compris l’isolement des souris TDSCs, la culture et l’expansion des souris TDSCs, la préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuille de cellule, la formation de feuille de cellule par la culture dans le milieu de stimulation, la préparation de la construction de cellules souches de tendon 3D, l’assemblage des cellules uniaxiales étirant le complexe mécanique de stimulation, et l’évaluation du tissu tendinien in vitro stimulé mécanique.
Isolement des souris TDSCs. Utilisé chez les souris qui sont des souris âgées de six à huit semaines par dislocation cervicale. Récolter les tendons de rotule et les tendons d’Achille.
Digérer le tendon avec la collagène de type 1 de six millilitres pendant trois heures. Recueillir les cellules et la culture dans l’alpha MEM complet contenant 10% de FBS et 1%de streptomycine et le mélange de pénicilline pendant sept jours. identifier les TDSC à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence par cytométrie d’écoulement, l’expression de marqueurs de surface cellulaire, y compris le CD44, le CD90 et le Sca-1.
Absence de l’expression de CD34 et CD45. Passer et congeler les cellules. Les cellules de passage seront utilisées pour d’autres étapes.
Culture et expansion des souris TDSC. Prenez les cellules souches du tendon des souris réchauffées. Ajouter lentement quatre à cinq millilitres supplémentaires d’alpha MEM complet.
Transférer le mélange dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres par une pipette. Garnir de moyen à un total de huit millilitres par une pipette. Placez le tube dans la centrifugeuse un équilibre de puits.
Cellules centrifugeuses à 347 g pendant cinq minutes. Sortez un tube de la centrifugeuse. Vérifiez la pastille en bas.
Décanter le milieu libre. Suspendre doucement les cellules dans un à deux millilitres de milieu complet. Évitez de faire trop de bulles.
Transférer les cellules re-suspendues dans un flacon T75 par une pipette. Utilisez une pipette pour ajouter un milieu alpha MEM complet au flacon pour atteindre un volume total de 10 millilitres avec une concentration finale de 13 000 cellules par centimètre carré. Placez le flacon dans l’incubateur et culturez-le à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone.
Changez le milieu tous les trois jours. Observez et surveillez les cellules au microscope lorsque vous changez le milieu jusqu’à ce que les cellules soient cultivés à 100 % de confluence. Préparation du milieu de culture de stimulation pour la formation de feuilles cellulaires.
Verser 15 millilitres de milieu alpha MEM complet dans un tube stérile de 15 millilitres. Ajouter six microlitres d’acide ascorbique dans un milieu de 15 millilitres à la concentration finale de 4,4 microgrammes par millilitre. Mélanger délicatement en inversant de haut en bas.
Formation de feuilles cellulaires en culturant dans le milieu de stimulation. Jetez soigneusement le milieu alpha MEM complet non normal. Évitez de toucher les cellules fixées au fond du flacon.
Ajouter 10 millilitres de stimulation moyenne lentement. Évitez de causer des perturbations aux cellules entièrement confluentes. Culture des cellules dans le milieu de stimulation pendant neuf jours et changer le milieu tous les trois jours pour générer suffisamment de feuilles cellulaires à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone.
Préparation de la construction de cellules SOUCHES de tendon 3D. Sortez le flacon de l’incubateur. Jeter complètement le milieu de stimulation.
Lavez la feuille de cellule monocouche avec PBS en faisant tourbillonnant le flacon. Jetez complètement le PBS. Utilisez une pipette pour ajouter un millilitre, 0,25% trypsine au coin de la fiole.
Appuyez sur le coin du flacon pour détacher la feuille de cellule monocouche jusqu’à ce que le coin de la feuille de cellule se lave du fond du flacon. Ajouter immédiatement neuf millilitres complète alpha MEM moyen pour arrêter la réaction de trypsinization. Continuer à tourbillonnant le flacon pour décoller complètement la feuille de cellule monocouche.
Verser le total pour fixer la feuille de cellule dans la boîte de Pétri avec moyen. Utilisez une pince stérile pour ramasser un coin de la feuille de cellule et tourner dans le sens des aiguilles d’une montre pendant 15 fois. Prenez une autre extrémité de la feuille cellulaire et tournez dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pendant 10 fois pour formuler une construction in vitro en forme de tendon.
Assemblage du complexe de stimulation mécanique uniaxial-étirement dans le bioréacteur conçu unique. Connectez les crochets par le connecteur, puis ajustez-les à deux centimètres entre deux crochets. Enroulez doucement les TDSC 3D construire sur le crochet de démonstration pour trois fois sur chaque crochet.
Fixez les crochets avec la construction cellulaire sur la chambre du bioréacteur en serrant les vis sur deux extrémités. Remplissez la chambre avec le support alpha MEM complet. Connectez l’accélérateur à la chambre culturelle par câble.
Couper le connecteur des crochets par des pinces stériles. Allumez la puissance et le contrôleur de canal pour démarrer une stimulation mécanique. Placez le couvercle sur la chambre, suivez les voyants indicateurs et assurez-vous que le bioréacteur peut fonctionner correctement.
Mettez le bioréacteur dans l’incubateur et soumettez la construction de cellules 3D à des étirements mécaniques. Le régime de chargement est de 6%, 0,25 fréquence Hertz, huit heures suivies de 16 heures de repos pendant six jours. Évaluation du tissu tendons-like in vitro stimulé mécaniquement.
desserrer les vis par un tournevis et enlever soigneusement l’assemblage. Mettez le tissu tendon-comme dans 4%PFA pour la fixation pendant 15 minutes, placez le tissu fixe tendon-comme dans une cassette de biopsie avec la biopsie des animaux familiers. Processus de déshydratation d’un échantillon.
Et enfin, évaluer par hd position histologique. Répétez l’ensemble du protocole et extrayez l’ARN du tissu tendin-like pour évaluer l’expression des marqueurs tenogenic par qPCR. Avant la stimulation mécanique, les CDD se développeront à 100 % de confluence dans le milieu complet et afficheront une morphologie structurale extérieure désorganisée.
Après six jours, vous avez ensuite vu l’étirement, la charge mécanique, la matrice extra cellulaire, et les alignements cellulaires étaient bien orientés. Les cellules étaient bien peuplées et bien enveloppées dans l’ECM après chargement mécanique. La morphologie cellulaire a été présentée pour être localisée et était plus semblable aux cellules normales de tendon comparées à celle avec sans étirement.
La densité cellulaire dans la construction cellulaire avec chargement était plus élevée que celle sans chargement. Les résultats de qPCR ont prouvé que les questions actuelles ont augmenté l’expression des marqueurs tenogenic, y compris le scleraxis, le Mohawk, la tenomoduline, et le collagène de type 1 comparés à ceux traités par la culture indiquée. En termes de système bioréacteur de stimulation mécanique, la chambre séparée avec le moteur linéaire a été employée dans notre protocole actuel.
Parce qu’il peut fournir une charge mécanique précise et il est portable et facile à ajuster par rapport à la façon dont la feuille de cellules 2D traditionnelles et l’étirement biaxial, la construction de cellules 3D est plus similaire à la forme réelle du tendon. Et l’étirement uniaxial est plus semblable aux caractéristiques des forces des cellules tendineuses. Cela fournit une base théorique de l’utilisation du système 3D uniaxial étiré pour stimuler la différenciation des TDSC.
Ainsi, la feuille de cellule 2D ont finalement été acheminées dans une construction de cellule 3D et ont subi uniaxial dans le protocole actuel. Selon notre système de bioréacteur, notre régime de chargement est de 6%, 0,25 fréquence Hertz, huit heures suivies de 16 heures de repos pendant six jours. Enfin, l’efficacité du protocole a été démontrée par la morphologie et le niveau d’expression des marqueurs tenogéniques.
L’ensemble du processus d’exploitation est simple, mais l’opérateur doit être attentif pour garder l’environnement de TDSC stérilisé en tout temps. Il existe de nombreuses applications de notre protocole. Le processus de stimulation des TDSC pour imiter la différenciation in vivo est utile pour l’étude du processus pathologique de tendinopathie.
En outre, ce protocole fournit une méthode reproductible pour la différenciation dirigée des TDSC en tissu tendinage-like. Ainsi, il peut être utilisé simplement et efficacement pour la culture potentielle du tendon d’ingénierie. En résumé, l’application d’un système de bioréacteur de stimulation mécanique uniaxiale 3D est simple, économique, reproductible, et une méthode valide pour induire la différenciation tenogenic des TDSCs.
Notre protocole fournit l’ensemble du processus en détail.
