이 방법은 눈에 적대적인 환경 때문에 도전적인 가능한 안구 결막 미생물을 식별합니다. 안구 미생물군유전체가 존재하는지, 안구 질환의 세균성 존재가 어떻게 변하는지에 대한 답을 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실행 가능한 미생물과 비실행성 미생물을 모두 식별하는 DNA 염기서열분석과는 달리,이 방법은 가능한 미생물만 식별하여 안구 공생 커뮤니티에 대한 명확한 이해를 합니다.
연구에 따르면 비자가면역및자가면역안구건조증과 같은 안구 질환을 진단하기 어려운 것은 독특한 안구 세균성 존재가 있는 것으로 내다볼 수 있다. 이 방법은 특유의 미생물 서명으로 안과 질환을 진단하는 데 사용될 수 있습니다. 먼저 면봉할 마우스 수에 적합한 양의 면 타격과 이쑤시개를 자동화한 다음, 면 타격의 1/2 센티미터 길이조각을 꼬집고 가장자리를 당겨 서 타격을 막기 직전에 멈추는 평평한 단일 다공성 층을 형성하여 애타게 합니다.
이쑤시개 끝에 늘어진 조각을 가볍게 잡고 이쑤시개 끝의 날카로운 끝 중 하나 주위에 타격을 소용돌이치십시오. 완성 된 눈 면봉은 팁에서 약 1/2 ~ 1 센티미터 까지 뻗어 있는 팁 위에 뻗어있는 면의 매우 얇은 층을 갖게됩니다. 면봉을 작은 비커에 넣고 옆으로 면봉한 다음 덮고 오토클레이브합니다.
오염을 최소화하기 위해 소독제로 작업 영역을 청소하고 멸균 뇌 심장 주입의 알리쿼트 0.5 밀리리터, 또는 BHI 미디어를 라벨1.5 밀리리터 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 분류합니다. 랙에 튜브를 캡하고 얼음에 랙을 설정합니다. 실험 마우스, 빈 멸균 케이지, 실온 마취, 25 게이지 바늘 및 1 밀리리터 주사기가있는 케이지를 포함하는 마우스 마취 스테이션으로 시작하여 왼쪽에서 오른쪽으로 워크플로우를 설정합니다.
다음으로, 얼음에 알리인용 BHI, 멸균 된 눈 면봉, 윤활 점안액, 생체 위험 용기, 깨끗한 종이 타월 및 70 %의 이소프로판올 스프레이가 들어있는 눈 면봉 스테이션을 준비하십시오. 마지막으로 실온 혈액 화천 플레이트, 10 마이크로리터 파이펫, 10 마이크로리터 멸균 일회용 팁 및 생체 위험 폐기물 용기가있는 도금 스테이션을 설치합니다. 뒷발 패드를 짜서 마우스가 제대로 마취되었는지 확인하십시오.
움직임이 없는 경우에만 진행합니다. 마취 된 마우스와 다른 손을 처리하여 눈 면봉과 문화를 처리하기 위해 한 손을 할당합니다. 케이지에서 마우스를 제거하고 왼쪽 눈이 노출된 측면에 위치하는 작업 표면 위에 놓습니다.
장갑을 낀 손을 이소프로파놀로 스프레이하고 종이 타월로 말리십시오. 전용 미디어 핸들링 핸드로 표시된 BHI 마이크로 원심분리기 튜브를 언캡하고 두 개의 튜브를 랙에 다시 배치합니다. BHI에 면봉의 면 코팅 된 끝을 찍어, 다음 여분의 액체를 제거하고 제거하기 위해 내부 튜브에 대해 두 번 팁을 소용돌이동안 튜브에서 면봉을 철회.
마우스 핸들링 핸드로 마우스를 목 덜미로 부드럽게 잡습니다. 반면에, 눈의 끝을 왼쪽 눈의 내측 결막 부위에 대고 놓습니다. 눈알을 가볍게 누르고, 낮은 눈꺼풀과 눈 사이의 세안 동작으로 면봉을 10번 움직이며 일정한 압력을 유지합니다.
모피를 만지지 않고 면봉 끝을 삽입한 위치에 수직으로 부드럽게 제거합니다. 면봉 면면을 BHI 미디어로 라벨이 붙은 마이크로 원심분리기 튜브에 직접 놓습니다. 면봉된 눈에 눈방울을 바르는 다.
원하는 경우 제어 시료를 위해 피부 또는 모피 면봉을 획득하여 각 면봉 사이에 적절하게 장갑을 살균합니다. 완료되면 마우스를 케이지로 반환합니다. 면봉이 얼음 위에 10-15분 동안 서게 한 다음 장갑을 낀 손을 살균하고 10회 회전을 위해 미디어에 팁을 혼합하면서 면봉을 제거합니다.
튜브의 내벽에 대한 팁을 5회 회전하여 회전하여 면봉을 철회하고 생체 위험 용기에 폐기하십시오. 각 마우스에 대한 프로세스를 반복합니다. 37°C에서 1시간 동안 튜브를 정적으로 배양하여 샘플을 풍부하게 합니다.
인큐베이션 하는 동안, 마우스 눈 면봉 또는 제어 면봉 당 하나의 실온 TSA 플레이트를 표시 하 고 반으로 분할. 인큐베이터에서 농축 된 샘플을 제거하고 얼음위에 놓습니다. 샘플을 짧게 소용돌이에 섞은 다음 샘플의 10 마이크로리터를 TSA 플레이트에 알리쿼트하고 플레이트를 기울여 스트립을 형성합니다.
이 것을 두 번 반복합니다. 플레이트 분할 선의 반대편에는 각각 10개의 마이크로리터샘플이 있는 10개의 점을 만듭니다. 100접시가 건조되는 것을 방지하는 깨끗한 챔버에서 18시간, 2일, 4일 동안 37°C의 플레이트를 배양합니다.
스트립의 식민지를 계산합니다. 형태학적으로 유사한 격리를 위해 면봉당 식민지 형성 단위를 계산합니다. 독특한 유기체가 스트립에 포착되지 않는 점을 살펴보십시오.
시각화를 용이하게 하기 위해 중간 및 오른쪽 플레이트에서 박테리아를 조밀하게 도금했습니다. 전형적으로, 우리는 눈 면봉 판에 있는 훨씬 더 적은 박테리아를 관찰했습니다. 경우에 따라 눈 면봉이 회수 가능한 박테리아를 생성하지 못할 수 있습니다.
C57 블랙 6 마우스에서 형태학적으로 다양한 분리가 있는 대표적인 눈 면봉판이 여기에 나와 있다. 각 고유의 격리에 대해, 식민지는 스트립에 계산되었고 상대적 풍요로움이 계산되고 플롯되었습니다. 미생물 특성화를 위해, 박테리아는 마스터 TSA 플레이트를 생성하기 위해 개별 마우스 눈 면봉 플레이트에서 수확되었다.
성장이 나타났을 때, 추가 시험은 미생물을 특성화하거나 확인하기 위하여 실행되었습니다. 마스터 플레이트는 각각의 분리를 확장하기에 충분한 접종을 제공하는 데 사용되었습니다. 격리를 식별하기 위해 TSA 플레이트가 하룻밤 사이에 줄무늬와 배양되었고 MALDI-TOF MS가 수행되었습니다.
여기에 표시된 분리물의 예는 연쇄상 구균 산산성소미니무스 및 에어로코커스 비리단으로 확인되었다. 기만 유기체의 상당히 다른 수준은 남성과 여성 C57 블랙 6 마우스에서 회복되었다. 연쇄상 구균 산성미니무스, 에어로코커스 비리단은 부정적인 황색 포도상 구균및 E.coli는 C57 블랙 6 N 마우스로부터 분리되었다.
이 프로토콜을 시도할 때 면봉을 얇게 코팅하고 눈 면봉 단계에서 시간을 내어 최상의 결과를 얻을 수 있음을 명심하십시오. MALDI-TOF MS에 대한 접근이 제한되는 경우, 격리는 미생물 및 생화학적 테스트에 의해 확인될 수 있다.
