Bu yöntem, gözlerin düşmanca ortamı nedeniyle zorlayıcı olan uygulanabilir oküler konjonktival mikroorganizmaları tanımlar. Oküler mikrobiyomun var olup olmadığını ve göz hastalığında bakteri varlığının nasıl değiştiğini cevaplana yardımcı olabilir. Hem uygulanabilir hem de canlı olmayan mikroorganizmaları tanımlayan DNA diziliminin aksine, bu yöntem sadece uygulanabilir mikroorganizmaları tanımlar ve bu da öküler kommenal topluluğun daha net anlaşılmasını sağlamakla sonuçlanır.
Çalışmalar, otoimmün olmayan ve otoimmün kuru göz gibi göz hastalıklarını teşhis örülmenin zor olduğunu ve benzersiz oküler bakteri varlığına sahip olduğunu göstermektedir. Bu yöntem, ayırt edici mikrobiyal imzalara sahip göz hastalıklarını teşhis etmek için kullanılabilir. Sürünecek fare sayısı için uygun miktarda pamuk vuruşu ve kürdanı otomatik olarak kapatarak başlayın, ardından 1/2 santimetre uzunluğunda pamuk vuruşu parçasını kıstırın ve vuruş dağılmadan hemen önce duran düz bir gözenekli tabaka oluşturmak için kenarları çekerek alay edin.
Bükülmüş olarak gerilmiş parçayı kürdan ucunda hafifçe tutarak vuruşu kürdanın keskin uçlarından birinin etrafında döndürün. Bitmiş göz çubuğu, uçtan yaklaşık 1/2 ila bir santimetre uzağa uzanan ucun üzerine gerilmiş çok ince bir pamuk tabakasına sahip olacaktır. Sürüntüleri küçük bir behere yerleştirin, aşağı doğru sürün, sonra örtün ve otoklavlayın.
Kontaminasyonu ve 0,5 mililitre steril beyin kalbi infüzyonunu veya BHI ortamını etiketli 1,5 mililitre steril mikro santrifüj tüplerine en aza indirmek için çalışma alanını bir dezenfektanla temizleyin. Tüpleri bir rafa takın ve rafı buza yerleştirin. Deneysel fareler, boş steril kafes, oda sıcaklığı anestezisi, 25 kalibre iğne ve bir mililitre şırınga ile kafesi içeren fare anestezi istasyonundan başlayarak soldan sağa iş akışını ayarlayın.
Daha sonra, buz üzerinde aliquoted BHI, sterilize göz çubukları, yağlama damlaları, biyolojik tehlike kabı, temiz kağıt havlular ve% 70 izopropanol spreyi içeren bir göz tarama istasyonu hazırlayın. Son olarak, oda sıcaklığında kan agar plakaları, 10 mikroliter pipet, 10 mikroliter steril tek kullanımlık uç ve biyolojik tehlike atık kabı ile kaplama istasyonunu kurun. Bir arka ayak pedi sıkarak farenin düzgün bir şekilde uyuşturulduğından emin olun.
Sadece hareket yoksa devam edin. Anesteziye bulaşmış fareleri işlemek için bir el, göz bezini ve kültürü işlemek için diğer ellerinizi atayın. Fareyi kafesten çıkarın ve sol gözü açıktayken yan tarafına yerleştirilmiş çalışma yüzeyinin üzerine yerleştirin.
Eldivenli ellere izopropanol püskürtün ve kağıt havlu ile kurulayın. Etiketli BHI mikro santrifüj tüpünü özel medya işleme eliyle çıkarın ve ikisini rafa geri yerleştirin. Göz küreğinin pamuk kaplı ucunu BHI'ye batırın, ardından fazla sıvıyı çıkarmak ve çıkarmak için ucu iç tüpe iki kez döndürürken küveti tüpten çekin.
Fare taşıma eliyle, fareyi boynun scruff'ından hafifçe tutun. Diğer taraftan, göz bezinin ucunu sol gözün medial konjonktival bölgesine yerleştirin. Göz küresini hafifçe bastırın ve bezi alt göz kapağı ile göz arasındaki bir pencere yıkama hareketinde 10 kez hareket ettirerek sürekli basıncı koruyun.
Kürke dokunmadan, çubuğun ucunu yerleştirildiği yere dik olarak hafifçe çıkarın. Çubuk pamuk tarafını doğrudan BHI ortamlı etiketli bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Sürünmüş göze bir göz damlası uygulayın.
İsterseniz, kontrol numuneleri için cilt veya kürk sürüntüleri alın, eldivenleri her çubuk arasında uygun şekilde sterilize edin. İşiniz bittiğinde, fareyi kafese geri döndürün. Bez buz üzerinde 10 ila 15 dakika bekletin, ardından eldivenli elleri sterilize edin ve ucu 10 dönüş boyunca medyada karıştırırken çubuğu çıkarın.
Ucu tüpün iç duvarına doğru beş dönüş boyunca döndürerek çubuğu çekin ve biyolojik tehlike kabına atın. Her fare için işlemi yineleyin. Tüpü statik olarak 37 santigrat derecede bir saat inkübe ederek numuneyi zenginleştirin.
Kuluçka sırasında, fare gözü çubuğu başına bir oda sıcaklığı TSA plakasını etiketleyin veya çubuğu kontrol edin ve ikiye bölün. Zenginleştirilmiş numuneleri inkübatörden çıkarın ve buza yerleştirin. Karıştırmak için örnekleri kısaca girdaplayın, ardından numunenin 10 mikrolitresini TSA plakasına koyun ve bir şerit oluşturmak için plakayı eğin.
Bunu iki kez tekrarlayın. Plakaların çizgiyi bölen diğer tarafında, her biri 10 mikrolitre örnekle 10 nokta oluşturun. Tabakları 37 santigrat derecede 18 saat, iki gün ve dört gün boyunca agar plakalarının kurumasını önleyen temiz bir odada kuluçkaya yatırın.
Şeritlerdeki kolonileri sayın. Morfolojiye dikkat edin ve morfolojik olarak benzer izolatlar için çubuk başına koloni oluşturma birimlerini hesaplayın. Şeritlerde benzersiz organizmaların yakalanmadığı noktalara bakın.
Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bakterileri orta ve sağ plakalarda yoğun bir şekilde kapladık. Tipik olarak, göz bezi plakalarında çok daha az bakteri gözlemledik. Bazen, göz sürüntülerinin geri kazanılabilir bakteriler vermeyebileceğini unutmayın.
Burada C57 siyah altı fareden morfolojik olarak farklı izolelere sahip temsili bir göz çubuğu plakası gösterilmiştir. Her ayrı izole için, koloniler şeritte sayıldı ve göreceli bolluk hesaplandı ve çizildi. Mikrobiyolojik karakterizasyon için, bakteriler ana bir TSA plakası üretmek için bireysel fare gözü çubuk plakalarından seçildi.
Büyüme ortaya çıktığında, mikropları karakterize etmek veya tanımlamak için ek testler yapıldı. Ana plaka, ilgili izolatları genişletmek için yeterli inokülyum sağlamak için kullanılmıştır. İzoleleri tanımlamak için bir gecede bir TSA plakası çizildi ve inkübe edildi ve MALDI-TOF MS yapıldı.
Burada gösterilen izolat örnekleri Streptococcus acidominimus ve Aerococcus viridans olarak tanımlanmıştır. Erkek ve dişi C57 siyah altı fareden önemli ölçüde farklı düzeylerde östensel organizmalar elde edildi. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagulates negatif Staphylococci ve E.coli C57 siyah altı N fareden izole edildi.
Bu protokolü denerken, en iyi sonucun çubuğu ince bir şekilde kaplayarak ve göz çubuğu adımı sırasında zaman alarak elde edileceğini unutmayın. MALDI-TOF MS'e erişim sınırlıysa, izolatlar mikrobiyolojik ve biyokimyasal testlerle tanımlanabilir.
