该协议描述了小动物生理学家可以利用的技术来阐明神经肽和其他调节消化和/或排泄系统激素因素的作用。这些技术允许测量微小尺寸的生物样品，否则使用专门为大型动物模型设计的技术（包括例如啮齿动物和远摄动物）将无法实现。这种方法可以提供对肠道内分泌调节的见解，包括运输上皮，以及与昆虫和类似大小的非昆虫物种的胃肠道相关的平滑肌。
演示昆虫肾输卵管程序的将是Farwa Sajadi，我实验室的博士候选人。此外，我的实验室Aryan Lajevardi的一名前研究生将展示以后肠为中心的协议。首先为实验准备拉姆齐和收缩测定皿。
使用移液器并用最多20微升的溶液填充孔。对于不受刺激的对照，用20微升的伊蚊盐水施耐德培养基填充孔中。一旦所有孔都填满，将水合的矿物油倒入测定皿中，直到孔和Minutien销被淹没。
将小管浸入孔中后，用镊子拾取小管的近端，将其从沐浴液滴中取出，并将末端缠绕在销子上。将小管缠绕在销子周围两次，保持留在沐浴液滴中的小管长度与其他小管一致。要制造钠选择性微电极，请使用一毫升注射器用100毫摩尔氯化钠回填电极。
确保回填液充满，直到电极尖端。如果出现气泡，请轻轻轻拂微电极或取出溶液并重新填充。将10微升移液器吸头浸入钠选择性离子载体溶液中。
将垂直于移液器的电极排成一行，然后将戴着手套的手指放在吸头底部以产生压力并排出一小滴离子载体。小心地将离子载体的液滴触摸到微电极尖端，确保不要破坏它。在半路上用100毫摩尔氯化钠填充一个小烧杯，并将一些建模粘土放在烧杯顶部的内部。
取出离子载体后，将电极尖端向下放在烧杯壁上，让尖端进入氯化钠。将 ISME 保存在烧杯中，直到它准备好使用。要制作ISME参比电极，请用500毫摩尔氯化钾回填电极并将其储存在烧杯中。
使用溶解在四氢呋喃中的约3.5%聚氯乙烯溶液涂覆电极尖端，以避免离子载体在浸没在石蜡油中时发生位移。要校准钠电极，将10微升氯化钠标准浓度的液滴放入Ramsey培养皿的边缘，并孵育Malpighian小管。将标准液滴分开两厘米，顶部浓度较高。
将参比电极和离子选择性电极插入氯化银线上，并使用连接到微型机械手的电极支架将其牢固地固定。使用微型机械手将两个电极导航到200毫摩尔氯化钠液滴，确保电头不会接触培养皿的底部。打开静电计开始记录，并使读数稳定下来。
记录读数并继续执行下一个标准。获得流体分泌速率的测量值后，使用微机械手小心地将参比电极和离子选择性电极移动到分泌的液滴中。打开录制并允许读数稳定，然后录制。
打开 IPA-2 离子/偏振放大器、光学显微镜和计算机。将钠选择性微电极放在由氯化银丝组成的支架上，并将其连接到母连接器插孔中。用氯化钾从烧杯中取出一个参比电极，将一根手指放在一端，并将玻璃毛细管向该手指倾斜以防止琼脂脱落。
小心地将一端放入支架中，确保不会形成气泡。如果有气泡，取出参比电极，用三摩尔氯化钾重新填充支架并重复。将电极支架放入母连接器插孔中。
校准后，解剖器官。将与解剖样品一起的聚-L-赖氨酸培养皿放在显微镜载物台上，并将参比电极的尖端插入盐水内。将离子选择性微电极的尖端浸没在盐水中，注意不要破坏尖端。
使用手动调节旋钮调整微电极位置，同时在光学显微镜下观察。调整微电极的垂直位置，使其尖端与器官或组织位于同一平面上，然后转动电机开关以启用。使用计算机箭头键，将微电极水平移动到距离组织三毫米的位置，以测量背景记录。
准备就绪后，按 F5 开始录制，获取背景活动的五个测量值。将微电极尖端靠近组织，注意不要刺穿器官。降低按键的灵敏度，将微电极尖端直接向右放置两微米，垂直于组织。
在直肠垫沿线的部位获得三次记录，以确定离子活性最大的部位，然后在显示最大活性的部位获得基线盐水测量值。为了记录后肠收缩，用已知体积的伊蚊盐水填充培养皿中的一个孔。解剖后，小心地将解剖的后肠连接到中肠中，放入另一个培养皿中的孔中，确保不要捏回肠。
将肠道浸入井内的盐水中，并将Minutien针放入肠道中部和直肠中。回肠不应处于紧张状态，应观察到源自前回肠幽门的自发性收缩。将摄像机连接到立体显微镜。
然后将装有解剖器官的培养皿置于显微镜下，并录制视频两分钟。将DH31应用于未受刺激的马尔皮吉安小管导致液体分泌速率显着增加，证实了其作为伊蚊利尿激素的作用。当用AedaeCAPA-1治疗肾小管时，在DH31刺激的马尔皮吉安小管中观察到分泌速率降低。
离子选择性电极用于测量分泌液滴中的钠浓度。在MT上处理DH31对分泌液滴中的钠浓度没有影响。然而，随着AedaeCAPA-1的应用，分泌液中的钠浓度显着增加。
此外，与未受刺激的对照相比，DH31导致显着更高的钠转运速率，而AedaeCAPA-1消除了DH31刺激小管的这种增加。SIET用于评估成年雌性蚊子直肠垫上皮的钠转运变化。使用亮氨酸类似物来检查钠吸收的变化，与盐水对照相比，钠吸收降低了四倍。
为了评估神经肽pyrokin2对回肠运动的作用，使用了Rhodnius prolixus类似物，该类似物先前已被证明可以激活富含蚊子回肠的埃及伊蚊PK2受体。相对于基线水平，PK2 可显著抑制回肠收缩。当使用Malpighian小管进行Ramsay测定并测量离子或液体分泌速率时，在解剖或转移到测定皿中时，小管必须不会受损。
在Ramsay测定之后，可以使用反向遗传技术在药理学或分子学上靶向特定的膜转运蛋白，以辨别它们对简单上皮中溶质的经上皮转运的特定贡献。
