이 프로토콜은 소화 및 배설 시스템을 조절하는 신경 펩티드 및 기타 호르몬 인자의 역할을 해명하기 위해 작은 동물 생리학자에 의해 이용 될 수있는 기술을 설명합니다. 이러한 기술은 설치류 및 텔레우스와 같은 대형 동물 모델을 위해 특별히 설계된 기술을 사용하여 는 불가능한 마이크로 크기의 생물학적 샘플을 측정할 수 있습니다. 이 방법은 곤충과 유사한 크기의 비 곤충 종에서 위장관과 관련된 부드러운 근육뿐만 아니라 상피 운반을 포함하여 창자의 내분비 조절에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
곤충 신장 관 절차를 시연하는 것은 파와 사자디, 내 실험실에서 박사 후보될 것입니다. 또한, 내 실험실 에서 전 대학원 생 Aryan Lajevardi 힌구트 초점을 맞춘 프로토콜을 시연 할 것 이다. 실험을 위한 램지와 수축 분석 요리를 준비하는 것으로 시작합니다.
파이펫을 사용하고 최대 20마이크로리터의 용액으로 우물을 채웁니다. 자극되지 않는 컨트롤의 경우, Aedes 식염수 슈나이더의 매체의 20 마이크로 리터로 우물을 채웁니다. 모든 우물이 채워지면 수화 미네랄 오일을 분석 접시에 붓고 우물과 미누티엔 핀이 물에 잠기때까지 붓습니다.
우물에 튜룰을 담근 후, 집게로 튜블러의 근위 쪽 끝을 집어 들고, 입물방울에서 제거하고, 핀 주위에 끝을 감쌉다. 다른 튜블러와 일치하는 목욕 물방울에 남아있는 튜블러의 길이를 두 번 핀 주위에 감싸십시오. 선택적 미세 전극을 만들려면 1밀리리터 주사기를 사용하여 100밀리머 나트륨 염화나트륨으로 전극을 충전하십시오.
백필 용액이 전극의 끝이 될 때까지 채워지도록 합니다. 기포가 나타나면 마이크로 전극을 부드럽게 쓸어 넘기거나 용액을 제거하고 리필하십시오. 10 마이크로리터 파이펫 팁을 나트륨 선택적 이오노포어 용액에 담급다.
파이펫에 수직으로 전극을 정렬한 다음 장갑을 낀 손가락을 끝 아래쪽에 놓고 압력을 만들고 작은 이오노포어 방울을 추방합니다. 마이크로 전광제 끝에 이오노포어 방울을 조심스럽게 만져 서 그것을 깨지 않도록 하십시오. 작은 비커를 100 밀리마일라 나트륨 염화나트륨으로 중간에 채우고 일부 모델링 점토를 비커 의 상단에 내부에 놓습니다.
이오노포어를 채택한 후 전극 팁을 비커 벽에 내려 놓고 염화나트륨 내의 팁을 놓습니다. ISME를 사용할 준비가 될 때까지 비커에 보관하십시오. ISME 기준 전극을 만들려면 전극에 염화칼륨 500밀리머칼륨으로 백필하여 비커에 보관하십시오.
파라핀 오일에 잠수했을 때 이오노포어의 변위를 피하기 위해 테트라하이드로푸란에 용해된 약 3.5%의 폴리염화비닐용액을 사용하여 전극 팁을 코팅한다. 나트륨 전극을 보정하려면, 인큐베이션 된 말피기안 튜블러와 램지 접시의 가장자리에 염화 나트륨 표준 농도의 10 마이크로 리터 방울을 배치합니다. 표준 물방울을 2센티미터 에 더 높은 농도로 두어 놓습니다.
염화물 은 전선 위에 기준 전극과 이온 선택적 전극을 모두 삽입하고 마이크로 조작기에 부착된 전극 홀더를 사용하여 안전하게 고정합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 200 밀리머 나트륨 염화 나트륨 방울을 향해 전극을 모두 탐색하여 전기 팁이 접시의 바닥에 닿지 않도록합니다. 전기계를 켜서 레코딩을 시작하고 판독값이 안정화되도록 합니다.
읽기를 기록하고 다음 표준을 계속합니다. 유체 분비 율의 측정을 얻은 후, 마이크로 조작기를 사용하여 기준 및 이온 선택적 전극을 분비된 액적물으로 조심스럽게 이동합니다. 레코딩을 켜고 판독값이 안정화되도록 한 다음 기록합니다.
IPA-2 이온/폴라로그래픽 증폭기, 광 현미경 및 컴퓨터를 켭니다. 은염화물 와이어로 구성된 홀더에 나트륨 선택적 미세 전전자를 놓고 여성 커넥터 잭에 부착합니다. 염화칼륨으로 비커에서 기준 전극 1개를 제거하고 한쪽 끝에 한 손가락을 놓고 유리 모세관을 이 손가락쪽으로 기울여 한천이 떨어지는 것을 방지합니다.
조심스럽게 거품이 형성되지 않도록 홀더에 한쪽 끝을 배치합니다. 거품이 있는 경우, 기준 전극을 제거하고, 3개의 어금니 칼륨으로 홀더를 리필하고 반복한다. 전극 홀더를 여성 커넥터 잭에 넣습니다.
교정 후 장기를 해부합니다. 폴리-L-리신 접시를 현미경 단계에 해부된 시료와 함께 놓고 식염수 내부에 기준 전극의 끝을 삽입합니다. 식염수에 이온 선택적 미세 전극의 끝을 침수, 팁을 깰하지 않도록주의.
수동 조정 노브를 사용하여 가벼운 현미경 아래에서 보이는 동안 미세 전극 위치를 조정합니다. 그 끝이 기관 또는 조직과 같은 평면에 있도록 마이크로 전자의 수직 위치를 조정한 다음 모터 스위치를 돌려 가능하게합니다. 컴퓨터 화살표 키를 사용하여 미세 전극을 조직에서 3밀리미터 떨어진 위치로 수평으로 이동하여 배경 기록을 측정합니다.
준비가 되면 F5를 눌러 녹음을 시작하고 백그라운드 활동의 다섯 가지 측정값을 가져옵니다. 미전전제 팁을 장기를 관통하지 않고 돌보는 조직에 가깝게 이동합니다. 미세 전하 팁 2 마이크로미터를 조직에 수직으로 직접 배치하여 키 적중 감도를 줄입니다.
직장 패드를 따라 사이트에서 세 개의 레코딩을 가져와 가장 큰 이온 활동의 부위를 식별한 다음 가장 큰 활동을 표시하는 사이트에서 기준식염수 측정값을 얻습니다. 힌드구트 수축을 기록하려면 요리의 우물 중 하나를 Aedes 식염수로 채웁니다. 해부에 따라, 조심스럽게 다른 접시에 우물에 중간 창자에 부착 된 해부 힌장을 전송, ileum을 꼬집어하지 않도록.
우물 안쪽의 식염수에 내장을 잠그고 미누티엔 핀을 중간 창자와 직장에 넣습니다. 장막은 장력 하에 있지 않아야하며 전방 일루의 유러믹 밸브에서 발생하는 자발적수축을 관찰해야합니다. 비디오 카메라를 입체 현미경에 연결합니다.
그런 다음 해부된 장기를 함유한 접시를 현미경 아래에 놓고 2분 동안 비디오를 녹화합니다. 자극되지 않은 말피기안 튜블러에 대한 DH31의 적용은 액분비율이 현저한 증가하여 Aedes 모기의 이뇨 호르몬으로서의 역할을 확인합니다. 튜블러가 AedaeCAPA-1로 치료될 때, DH31에서 분비율의 감소가 말피기안 튜블러를 자극하는 것으로 관찰된다.
이온 선택적 전극은 분비된 물방울에서 나트륨 농도를 측정하는 데 사용되었다. MT에 DH31의 치료는 분비 된 액적에서 나트륨 농도에 영향을 미치지 않았다. 그러나, AedaeCAPA-1의 적용으로, 분비된 액체에 있는 나트륨 농도가 현저하게 증가했습니다.
또한 자극되지 않은 제어에 비해 DH31은 나트륨 수송속도가 현저히 높아졌고, AedaeCAPA-1은 DH31 자극 튜블러의 증가를 폐지했습니다. SIET는 성인 여성 모기의 직장 패드 상피를 따라 나트륨 수송의 변화를 평가하는 데 사용되었습니다. 류코키닌 아날로그는 나트륨 흡수의 변화를 검사하는 데 사용되었으며, 이로 인해 식염수 조절에 비해 나트륨 흡수가 4배 감소했습니다.
일막 운동성에 대한 neuropeptide pyrokinin2의 역할을 평가하기 위해, 론드니우스 prolixus 아날로그가 사용되었으며, 이는 이전에 모기 장막에 농축된 A.aegypti PK2 수용체를 활성화시키는 것으로 나타났다. 기준선 수준에 비해 PK2는 장골 수축을 현저히 억제합니다. 말피기히안 튜블러로 램지 분석을 수행하고 이온 또는 유체 분비 속도를 측정할 때, 해부 중 또는 분석 접시로 옮기는 동안 튜벌레가 손상되지 않는 것이 필수적입니다.
램지 분석에 따라, 특정 멤브레인 수송기는 간단한 상피에서 솔테의 환피성 수송에 그들의 특정 기여를 분별하기 위하여 역 유전 기술을 사용하여 약리학적으로 또는 분자적으로 표적으로 할 수 있습니다.
